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在烟草中RSG(repression of shoot growth)是一个含有碱性亮氨酸拉链(bZIP)的GA合成调控转录因子,通过调节GA合成关键酶KO(贝壳杉烯氧化酶)和GA20ox1 (GA18氧化酶)的表达来控制内源GA含量。RSG与GA20ox1启动子的结合受烟草体内GA含量的反馈调节。14-3-3蛋白是植物体内一种重要的调控蛋白,通过与植物中多种信号传导相关蛋白的相互作用调节植物对外界环境刺激的应答。当烟草体内GA含量降低或应用PAC(多效唑,内源性GA合成抑制剂)抑制GA合成时,细胞质中的14-3-3蛋白与RSG结合能力降低,增加RSG进入细胞核的作用,RSG与KO和GA20ox1启动子结合提高它们的表达水平,GA合成量增加；反之,添加外源GA时则增强14-3-3蛋白与RSG的结合将RSG限制在细胞质中,RSG与KO和GA20ox1启动子结合被抑制,它们表达水平下降,GA的合成量减少。本实验室的研究表明,甲醇和乙醇刺激影响GA合成调控相关基因及]4-3-3蛋白的表达；GA的施用增加植物抵抗干旱胁迫的能力。有些研究表明GA还和植物对铝胁迫的应答和耐铝能力有关。本论文用外源GA和PAC处理野生型(WT)烟草改变烟草GA的含量,通过过量表达或RNAi干扰RSG/14-3-3蛋白的表达产生转基因烟草,分析WT和转基因烟草中RSG与14-3-3的表达、互作及与GA20ox1启动子结合应答甲醇／乙醇刺激和干旱及铝胁迫的模式,研究烟草RSG与14-3-3蛋白应答甲醇或乙醇刺激及2种非生物胁迫的分子机理。获得如下主要结果：为了考察甲醇和乙醇促进植物生长是否和GA的合成有关,本研究在MS固体培养基上,分析添加外源GA和PAC对2mM甲醇和乙醇刺激WT烟草生长的影响。结果表明外源GA的添加增强甲醇和乙醇对烟草生长的刺激作用,而添加PAC抑制甲醇和乙醇对烟草生长的刺激作用。对GA含量的分析结果证实甲醇和乙醇的刺激增加烟草中GA的合成。RT-PCR分析表明甲醇和乙醇的刺激诱导烟草14-3-3基因的转录和表达,对RSG蛋白表达也有诱导作用。免疫共沉淀分析结果表明甲醇和乙醇刺激在增强14-3-3蛋白与RSG的相互作用和RSG与GA20ox1启动子的结合。这些说明甲醇和乙醇刺激通过增加烟草中14-3-3蛋白和RSG的表达来增强RSG与GA20ox1启动子的结合促进GA合成的同时,也增加14-3-3蛋白和RSG的相互作用。为了验证RSG与14-3-3蛋白在烟草应答甲醇和乙醇刺激中的作用,用CaMV35S启动子构建RGS的过量表达载体pK2-35S-RSG和干扰载体pK7-35S-RSG-I-RSG,转化WT烟草获得4个(RO1-4) RSG过量表达株系和3个(RI7、8、10) RSG抑制表达株系,RO的4个株系GA含量高于WT,而RI的三个株系GA含量低于WT。用2 mM甲醇和乙醇分别处理本实验室郭传龙硕士论文制备的14-3-3蛋白(过表达株系S23、抑制表达株系RE5)和RSG转基因(R03和RI10)植株,结果发现S23和R03的根伸长量和鲜重增加量均显著大于WT,在RI10和RE6中的结果相反。与WT相比,R03和RE5中GA的含量增加,而RI1 0和S23中GA的含量降低。免疫共沉淀分析证实R03和RE5植株中RSG与GA20ox1启动子的结合量则大于WT,而RI1 O和S23植株中RSG与GA20ox1启动子的结合量则小于WT。在R03和S23植株中负责磷酸化RSG的蛋白激酶CDPK的表达水平高于WT,因此14-3-3蛋白与RSG的相互作用大于WT；而在RI10和RE5中CDPK的表达水平低于WT,因此]4-3-3蛋白与RSG的相互作用小于WT。用2%PEG6000模拟干旱胁迫处理WT烟草,结果说明随着处理时间的增加烟草失水率逐渐增大,同时烟草的蒸腾速率、净光合速率、气孔转导率及胞间C02浓度降低,叶片出现萎蔫症状。在PEG溶液中添加PAC抑制GA的合成时进一步降低蒸腾速率和气孔导度及净光合速率,烟草失水率和萎蔫症状加剧,说明抑制GA的合成降低烟草的抗旱能力。在PEG溶液中添加GA后蒸腾速率和气孔导度及净光合速率提高,烟草失水率减少,萎蔫症状缓解,说明增加GA的含量提高烟草的抗旱能力,GA缓解烟草的干旱症状通过增加其吸水能力实现。PEG胁迫烟草降低GA含量,在PEG溶液中添加PAC则使GA的含量进一步降低,添加GA使烟草中GA含量提高。RT-PCR分析表明PEG胁迫诱导烟草RSG和CDPK的表达,在PEG溶液中添加PAC减弱PEG对CDPK表达的诱导作用,添加GA则增强PEG对CDPK表达的诱导作用。免疫共沉淀分析表明PEG胁迫增强RSG与]4-3-3蛋白互作的同时减弱RSG与GA20ox1启动子的结合；在PEG溶液中添加GA进一步增强RSG与14-3-3蛋白的相互作用,同时减弱RSG与GA20ox1启动子的结合能力；添加PAC则进一步降低RSG与14-3-3蛋白的相互作用,但增强RSG与GA20ox1启动子的结合。用2%的PEG处理WT和RO3、RI10转基因烟草,结果说明在PEG胁迫下R03的失水率小于WT,但其蒸腾速率、净光合速率、气孔转导率及胞间C02浓度均大于WT；而RI10的失水率大于WT,但其蒸腾速率、净光合速率、气孔转导率及胞间C02浓度均小于WT。这些结果说明增强RSG的表达提高烟草的耐旱能力和及其在干旱胁迫下的净光合速率,抑制RSG表达则降低其抗旱能力和净光合速率。在2%PEG胁迫12h后,RSG与GA20ox1启动子的结合能力大于WT,使RO3中GA含量高于WT, RSG与14-3-3蛋白的互作水平也高于WT；而在RI10中RSG与GA20ox1启动子的结合能力小于WT,这使GA含量低于WT, RSG与14-3-3蛋白的互作水平也低于WT。铝毒最明显的症状是抑制植物根的生长。在50μM铝胁迫下,WT烟草根的相对生长率(RRG)逐渐减小,根中GA的含量逐渐降低,说明铝胁迫抑制烟草根中GA的合成。在铝胁迫下添加外源GA时,WT烟草根的伸长作用明显恢复,而添加PAC时,加剧铝胁迫对根伸长的抑制作用。免疫共沉淀分析证实铝胁迫也降低RSG与GA20ox1启动子的结合。RT-PCR分析结果表明铝胁迫诱导WT烟草14-3-3基因中a、b、d、e、h和i亚型及RSG的转录,对CDPK的转录无明显影响。Western blot分析表明铝胁迫增强WT烟草14-3-3蛋白的表达但抑制RSG蛋白的表达,降低14-3-3蛋白与RSG的相互作用。过量表达RSG增强R03中GA的含量极其对铝胁迫的抗性,RSG与GA20ox1启动子的结合增强,抑制RSG表达降低RI10根中GA的含量极其对铝的耐受性,RSG与GA20ox1启动子的结合减弱。