中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary,CHO）细胞是目前生物制药领域应用广泛的生产细胞。传统构建重组细胞株的方法是将目的基因随机整合到染色体基因组中并经过多次压力筛选获得高表达水平的目的细胞株,整个过程费时费力,并且经常由于整合位点的不稳定性随着传代次数增加非生产性细胞克隆逐渐增多,导致产量下降。寻找稳定的整合位点,使用定点整合的方法将外源基因定点整合至CHO细胞基因组的稳定位点,有望缩短克隆细胞株的构建周期并解决稳定性问题。课题组前期通过慢病毒示踪Zsgreenl基因及染色体步移技术,发现6个潜在定点表达位点。本研究利用CRISPR/Cas9技术对染色体NW003614241.1上148052～148157 bp范围内进行外源基因的定点整合和表达稳定性研究,为该位点的进一步开发利用奠定基础。（1）以前期通过慢病毒转染技术构建的随机整合了绿色荧光蛋白Zsgreen1基因的重组Bak/Bax双敲除CHO-K1细胞株1g11（简称1g11）为研究对象,使用倒置荧光显微镜和流式细胞仪定性定量分析细胞的平均荧光强度,表征Zsgreen1基因的表达情况。对贴壁和悬浮状态下的1g11细胞均连续传代培养60代次,发现所有1g11贴壁细胞和悬浮细胞绿色荧光强度稳定,证明此位点可以稳定表达Zsgreen1基因。（2）使用 CCTOP CRISPR/Cas9 在线预测系统,在 CHO 细胞 NW003614241.1 上148052～148157 bp 区域内寻找打靶位置。挑选 5’-ACCCTTGTGCCCCAAAGACAGGG-3’为靶序列,构建sgRNA质粒,转染Bak/Bax双敲除CHO-K1细胞株Ie3（简称Ie3）后,经琼脂糖凝胶电泳和测序验证,sgRNA可以在目标靶点进行编辑,编辑效率约为69.5%,说明此位点可以被编辑。（3）EGFP供体质粒上设计的元件包括5’同源臂、增强绿色荧光蛋白（Enhanced Green fluorescent protein,EGFP）基因表达盒、嘌呤霉素（Puromycin,Puro）基因表达盒和3’同源臂。使用CRISPR/Cas9技术,三质粒共转染,利用同源修复使5’同源臂和3’同源臂之间的EGFP基因和Puro基因整合至Ie3基因组。经Puro加压筛选、流式细胞仪分选、PCR扩增验证,共获得3株成功敲入EGFP基因的重组单克隆细胞株EGFP-Ie3-19、EGFP-Ie3-48、EGFP-Ie3-51,而且阳性单克隆均为杂合子。经测序验证,敲入位置均在染色体NW003614241.1上的第118097 bp处。悬浮驯化筛选出来阳性单克隆株,使用流式细胞仪观察EGFP基因的表达情况,发现在连续悬浮传代培养60代次的过程中,各代次的阳性单克隆细胞株可以稳定表达绿色荧光蛋白,表明EGFP基因可定点整合至该位点并稳定表达。（4）利用Kpn Ⅰ和Xma Ⅰ两个酶切位点,在EGFP供体质粒上通过酶切连接的方式加入人血清白蛋白（Humanserumalbumin,HSA）基因,构建HSA供体质粒。同理,三质粒共转染在Ie3基因组中定点敲入分泌蛋白HSA基因。经Puro加压筛选、流式细胞仪分选、Dot blot筛选、PCR扩增和Western blot验证,共获得3株成功敲入HSA基因的重组单克隆细胞株HSA-Ie3-4、HSA-Ie3-52、HSA-Ie3-61,而且阳性单克隆均为杂合子。经测序验证,敲入位置均在染色体NW003614241.1 上的第 118097 bp处。悬浮驯化筛选出来阳性单克隆株,批次培养定量检测HSA蛋白的表达水平。发现HSA-Ie3-4的生长状态和HSA表达量最优,为13.6 mg·L-1,随后流加培养HSA-Ie3-4,HSA表达量为14.23 mg·L-1。之后在CD CHO无血清培养基中添加丁酸钠和柠檬酸铁进行初步优化,发现丁酸钠的添加浓度为3 mmol·L-1时,蛋白表达量为19.35 mg·L-1,效果最好,提高了36.0%;当柠檬酸铁的添加浓度为0.5 mmol·L-1时,蛋白表达量为16.35 mg·L-1,效果最佳,提高了 14.9%。研究结果表明,胞内表达的EGFP和胞外分泌表达的HSA均可在CHO细胞染色体NW003614241.1上148052～148157 bp区域内进行定点整合并稳定表达。