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DNA的大部分区域通过包装成特殊的染色质结构而失去活性称为染色质沉默。这些特殊的染色质结构在维持染色体结构稳定和基因表达调控中起重要作用。组蛋白去乙酰化酶Sir2(Silencinginformationregulator2)是参与染色质沉默的一种重要的蛋白质。它存在于从酵母到人类的各种生物中,具有高度的保守性。其中在酵母中共发现四个Sir2同源蛋白,它们的主要功能是调控基因沉默、细胞分裂、DNA断裂后的修复以及能量的调控等。在人类中也发现了7个Sir2同源蛋白(SIRTl一SIRT7),通过功能分析,发现其也具有酵母Sir2同源蛋白相似的生物功能。
与酵母和动物的研究相比,有关植物Sir2的生物学功能研究鲜见报道,本论文主要从蛋白水平上对水稻(OryzasativaL)Sir同源蛋白进行了分析,主要结果如下:
1:从粳稻品种中花¨中克隆到两个同源Sir2基因,其分别位于水稻第4染色体和第12染色体,将位于第4染色体的基因命名为OsSir2-1,位于第12染色体的基因命名为OsSir2-2,通过生物信息学分析,发现其与其它Sir2同源蛋白具有很高的同源性。
2:分别取中花¨发芽一周后的幼苗和幼根以及减数分裂期的小穗和成熟叶片作为材料抽提蛋白进行WesternBlot,分析OsSir2在不同组织器官的表达模式,发现OsSir2—1在幼根、幼叶以及穗中表达;而OsSir2-2只在叶中表达。同时构建了瞬时表达载体转化洋葱表皮细胞分析OsSir2的亚细胞定位情况,发现OsSir2—1和OsSir2-2分别定位于细胞核和细胞质中,与PSORT的预测结果相符。
3:将OsSir2—1和突变OsSir2—1(134位的组氨酸变为亮氨酸)克隆于原核表达载体pGEX4T-2,通过诱导条件优化得到可溶性的OsSir2—1重组蛋白及其突变蛋白,并在pH8.0测到OsSir2一l重组蛋白的组蛋白去乙酰化酶活性而其突变重组蛋白没有活性,结果说明OsSir2—1具有组蛋白去乙酰化酶活性并且其134位组氨酸为影响其活性的重要氨基酸。
4:利用WesternBlot对Tl代反义和超表达转化苗的OsSir2.1蛋白表达量及其相应的组蛋白H3乙酰化程度进行了检测,反义转化苗中OsSir2一l的表达量降低而组蛋白H3乙酰化程度提高,同时超表达转化苗中OsSir2—1的表达量升高而组蛋白H3乙酰化程度降低,推测OsSir2一l的表达量高低直接影响着H3乙酰化程度。