背景:肠道病毒D68（EV-D68,Enterovirus D68）是一种呼吸道系统疾病的病原体,可导致呼吸系统疾病,严重时引起神经系统疾病。2014年在美国大爆发后,EVD68被证实与急性无力脊髓炎（AFM,Acute Flaccid Myelitis）的发病有关,在全球范围内引起广泛关注。目前,并无针对EV-D68的特效药物或者预防EV-D68的疫苗。锌离子通过破坏病毒多肽的合成、抑制病毒基因组的翻译和复制、干扰病毒与宿主细胞膜的融合以及促进病毒脱衣壳等机制发挥抗病毒作用。临床上,锌离子已被纳入一些抗病毒疗法。例如,人类免疫缺陷病毒（HIV,Human Immunodeficiency Virus）,慢性丙型肝炎病毒和病毒性疣的治疗等。锌离子具有抗多种RNA病毒和DNA病毒的活性,包括冠状病毒,单纯疱疹病毒（HSV,Herpes Virus）,丙型肝炎病毒（HCV,Hepatitis C Virus）,人乳头瘤病毒（HPV,Human Papilloma Virus）等,而EV-D68显著区别于上述病毒,例如有无包膜,病毒核酸种类,感染方式,传播途径等皆不同于上述病毒。目前尚无锌离子抑制EV-D68的相关报道。病毒的复制依赖宿主细胞提供条件,因此病毒进化出了多种机制来操控感染病毒的宿主细胞内环境,满足病毒复制的需求,以提高复制的效率。病毒对细胞周期的调控是机制之一,许多病毒将细胞周期阻滞于最有利于其复制的时期。锌离子参与调控细胞周期上的很多检验点,具有调控细胞周期的作用。我们研究锌离子能否通过调控细胞周期分布,从而发挥抗EV-D68感染的作用,并利用m RNA测序筛选出影响EV-D68感染性的关键基因并加以验证,揭示锌离子的抗病毒作用机制。方法:1.锌离子在体内和体外对EV-D68复制的影响（1）锌离子对EV-D68引起的致细胞病变效应（CPE,Cytopathic Effect）影响:EV-D68（Fermon株,MOI=0.1）感染RD细胞2 h,实验组添加锌离子（浓度:0.1 m M）处理48h,观察细胞病变效应。（2）锌离子对子代病毒生成的影响:EV-D68感染后,实验组添加锌离子分别处理24 h或48h,在感染后0h、6h、8h、10h、12h、20h、24h或48h收集病毒上清,滴定法检测病毒滴度;免疫印迹法（Western Blot）检测上清中子代病毒结构蛋白VP1表达。（3）锌离子对病毒胞内复制的影响:EV-D68感染2 h,实验组添加锌离子分别处理24h或48h,分别在感染后0h、6h、8h、10h、12h、20h、24h或48h收集细胞,免疫印迹法检测细胞内病毒蛋白VP1表达。（4）锌离子对EV-D68流行株感染的抑制作用:EV-D68流行株MO和KY（MOI=0.1）感染2 h后,实验组添加锌离子48h,观察致细胞病变效应,收集细胞,检测细胞内病毒复制水平及上清中子代病毒数量。（5）多种锌盐对EV-D68感染的抑制作用:EV-D68感染2 h后,添加相同浓度的醋酸锌、硫酸锌和氯化锌处理细胞48 h,观察致细胞病变效应,收集细胞,检测细胞内病毒复制水平及上清中子代病毒的生成。（6）锌离子在不同的EV-D68敏感细胞系中的抗病毒作用:EV-D68（MOI=0.1）感染A549和Hela后,添加锌离子处理48h,免疫印迹法检测细胞和上清中病毒蛋白VP1的表达,检测上清中病毒滴度。（7）锌离子载体吡咯烷二硫代甲酸铵（PDTC）对EV-D68复制的影响:感染EV-D68后,分别用PDTC,锌离子（锌离子浓度为0.0005 m M）,PDTC与锌离子联合（锌离子浓度为0.0005 m M）在无血清条件下处理细胞48h,观察致细胞病变效应,检测细胞内病毒蛋白VP1表达及上清中子代病毒的生成。同时,PDTC处理分别在有无血清的条件下感染EV-D68的RD细胞,检测上清中病毒滴度。（8）锌离子对感染EV-D68乳鼠体内病毒复制的影响:在2日龄乳鼠颅内注射EV-D68流行株MO（US/MO/14-18947）造模,实验组从攻毒后次日通过腹腔注射氯化锌溶液给药,检测攻毒后2,3,4,6日三种组织（骨骼肌,肺和脊髓）内病毒载量,病毒抗原表达和组织病理变化。2.锌离子抗EV-D68感染的机制研究（1）锌离子对EV-D68吸附（attach）和进入（entry）的影响:RD细胞分别在4℃和37℃时感染EV-D68（MOI=0.1）,同时,实验组添加锌离子,2h后q RT-PCR检测细胞内病毒RNA水平。检测锌离子对EV-D68的预防作用:实验组预先添加锌离子孵育RD细胞24h,随后,分别在4℃和37℃感染EV-D68（MOI=0.1）,2h后q RT-PCR检测细胞内病毒RNA的水平。（2）锌离子逆转EV-D68对细胞周期的调控:使用无血清DMEM培养RD细胞24h后感染EV-D68（MOI=0.1）,实验组添加锌离子,重新用含10%血清的DMEM培养细胞24h后,检测细胞周期分布和CDK4,CDK6和Cyclin D的RNA水平。（3）锌离子对感染EV-D68细胞的细胞周期的影响与其抗EV-D68感染关系:分别在无血清培养基和含10%血清的DMEM培养基体系中进行实验。RD细胞在两种体系中培养24h后,感染病毒后24h检测细胞周期的分布,以及上清和细胞内VP1的RNA水平。（4）锌离子调控细胞周期的方式:使用胸苷（Thymidine）和诺考达唑（Nocodazole）预处理RD细胞24h后感染EV-D68（MOI=0.1）,继续用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养细胞24h后,检测对照组和实验组细胞周期的分布。（5）锌离子对细胞周期蛋白与蛋白激酶复合物表达的影响:EV-D68（MOI=0.1）感染对照组和实验组24h之后,用免疫印迹法检测CDK1,Cyclin B1和Cyclin D的蛋白表达;细胞内和上清中病毒蛋白VP1的表达。用q RT-PCR检测Cyclin D,CDK4,CDK6,CDK1和Cyclin B1的RNA水平。（6）锌离子螯合剂（TPEN）对锌离子调控细胞周期的作用:EV-D68（MOI=0.1）分别感染对照组,锌离子组（浓度:0.1 m M）,TPEN组,锌离子与TPEN合用组24h后,检测细胞周期的分布。3.影响EV-D68感染性的关键基因的筛选及验证:EV-D68（MOI=0.1）感染对照组和实验组24h之后（此时未出现CPE）,收集细胞进行m RNA测序。对转录组测序结果进行差异表达分析,GO富集分析,构建蛋白互作网络PPI并鉴定参与锌离子影响病毒复制和调控细胞周期的HUB基因。同时,结合差异基因倍数和GO富集分析,我们筛选出影响细胞周期的关键基因。验证敲低或过表达该基因对细胞周期的影响和EV-D68感染性的影响。结果:1.锌离子在体内和体外对EV-D68复制的影响（1）锌离子减轻了EV-D68诱导的CPE:锌离子减少了感染EV-D68的RD细胞变圆、脱落、聚集和死亡现象。（2）锌离子减少了子代病毒的生成:在多个时间点（感染后8h至24h）,实验组上清中VP1的蛋白表达减少,感染后48h实验组的病毒蛋白VP1和病毒滴度均降低。（3）锌离子对EV-D68胞内复制的抑制作用:在EV-D68复制早期（感染后8h,10h和12h）,实验组细胞内病毒蛋白VP1表达降低,经过多轮复制之后,细胞内VP1的表达趋近一致。（4）锌离子对EV-D68的流行株具有抑制作用:锌离子减轻了EV-D68流行株MO和KY诱导的CPE,减少了上清中病毒蛋白VP1表达,降低了上清病毒滴度。（5）多种锌盐均对EV-D68有抑制作用:醋酸锌、硫酸锌和氯化锌均减轻了EV-D68诱导的CPE,减少了上清中病毒蛋白VP1表达,降低了上清病毒滴度。（6）锌离子对其他感染EV-D68的细胞系具有抗病毒作用:锌离子降低了感染EV-D68的A549和Hela细胞系上清中的病毒蛋白VP1表达和上清中病毒滴度。（7）锌离子对EV-D68的抑制作用可以被PDTC加强:在无血清条件下,0.0005 m M锌离子不能减轻病毒所致CPE,不能减少感染EV-D68的RD细胞胞内VP1表达和上清中病毒滴度;PDTC不能减轻病毒所致CPE,不能减少胞内VP1表达,但能降低上清中病毒滴度;0.0005 m M锌离子与PDTC合用时显著减轻了CPE,降低了胞内VP1表达和病毒滴度。在含10%血清的培养基中,PDTC的抗病毒能力显著高于其在无血清培养基中的抗病毒能力。（8）锌离子可以抑制EV-D68在新生乳鼠肺、脊髓和骨骼及内的复制:锌离子组乳鼠的肺、脊髓和骨骼肌内病毒载量显著降低,IHC结果显示锌离子组乳鼠病毒抗原在组织内的表达均降低。2.锌离子抗EV-D68感染的机制研究（1）锌离子预先孵育细胞24h后显著抑制EV-D68的吸附和进入作用,与对照组相比,锌离子组的VP1的RNA水平显著降低。锌离子对RD细胞具有保护作用。在感染病毒的同时加入锌离子,分别检测EV-D68的吸附和进入能力,对照组和锌离子组VP1的RNA水平没有显著差异。（2）锌离子逆转EV-D68诱导的G1期细胞阻滞:与阴性对照组相比,对照组CDK4,CDK6和Cyclin D的RNA水平显著降低。与对照组相比,实验组CDK4,CDK6和Cyclin D的RNA水平显著升高;实验组G1期细胞数百分比显著降低。（3）锌离子逆转EV-D68诱导的G1期阻滞可抗EV-D68感染:在有无血清两种体系中进行实验,感染病毒后24h,实验组G1期细胞数百分比减少,G2期细胞数百分比增多;实验组上清和细胞内VP1的RNA水平均降低。（4）锌离子介导细胞G2阻滞:与胸苷处理组相比,实验组S期细胞数百分比显著减少,G2期细胞数百分比显著增加;与诺考达唑处理组相比,实验组G2期细胞数百分比显著增加,G1期细胞数百分比显著降低。（5）锌离子抑制CDK1/Cyclin B1翻译后表达:与阴性对照组相比,对照组CDK4,CDK6和Cyclin D的RNA水平显著降低。与对照组相比,实验组CDK4,CDK6和Cyclin D的RNA水平显著升高;实验组Cyclin B1和CDK1蛋白表达显著降低,Cyclin D蛋白表达升高;实验组上清中VP1蛋白表达显著降低,细胞内VP1蛋白表达无明显变化。（6）锌离子螯合剂TPEN逆转锌离子介导的G2期阻滞:与对照组相比,锌离子组G1期细胞数百分比显著降低,G2期细胞数百分比显著增加;与锌离子组相比,TPEN组G1期细胞数百分比显著增加,G2期细胞数百分比显著降低。3.影响EV-D68感染性的关键基因的筛选及验证:确定了E2F1和EGR1是影响EV-D68感染性的关键基因并进行验证。经实验验证,EV-D68感染敲低E2F1的293T细胞系,细胞内VP1蛋白水平增加,上清病毒滴度显著升高;反之,EVD68感染过表达E2F1的293T细胞系,细胞内VP1蛋白水平降低,上清病毒滴度显著下降。EV-D68感染过表达EGR1的293T细胞系,细胞内VP1蛋白水平增加,上清病毒滴度显著升高。结论:（1）锌离子在体外有效抗EV-D68原始株和流行株的感染。（2）锌离子提前孵育细胞对细胞具有保护作用,可预防EV-D68的感染。（3）锌离子可抗乳鼠体内EV-D68的感染。（4）锌离子逆转EV-D68诱导的G1期阻滞可抗EV-D68感染。锌离子通过促进S期向G2期转化和阻止细胞离开G2期介导G2期阻滞。锌离子介导G2期阻滞可能与抑制CDK1/Cyclin B1复合物翻译后的表达有关。（5）E2F1和EGR1是宿主细胞内影响EV-D68复制的关键基因,过表达E2F1抑制EV-D68复制;敲低E2F1促进EV-D68复制;过表达EGR1促进EVD68复制。