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第一部分以Candidasp.尿酸酶为模型考察用积分法测定米氏常数(Michaelis-Mentenconstant,Km)及黄嘌呤对其抑制常数(inhibitionconstant,Ki)所需条件。用293nm吸收变化记录尿酸酶反应,用积分法确定表观米氏常数(apparentMichaelis-Mentenconstant,Kmapp)和表观最大反应速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp)。据上述参数随抑制剂浓度的变化确定抑制类型和Ki。被分析数据中的畸异值显著降低结果可靠性。通常终点底物浓度小于1/6Kmapp而起始底物浓度足够高,此积分法测定Kmapp的偏差和变异小于20%而Vmapp精度更高。用积分法所得Kmapp与双倒数法一致,且和黄嘌呤浓度成正比,对应Ki为(5.4±0.8)μmol/L(n=3),也与双倒数法一致。被分析数据精度足够高,用无抑制剂~lKm的4倍以上起始底物浓度,并固定终点底物浓度小于1/6Km,此积分法能高效且低成本筛选特殊类型的抑制剂。
第二部分以Bacillusfastidiosus胞外尿酸酶为模型考察用简化积分法测定较低底物浓度测定黄嘌呤Ki的可靠性。用简化积分速度方程拟合反应过程确定Vm/Km,据Km/Vm随黄嘌呤浓度的变化确定Ki,同时用测定半抑制浓度法测定黄嘌呤对其Ki。两种方法所得结果均与双倒数法无统计差异,但简化积分法成本低,抗干扰能力更强。在实践中对于已知抑制类型抑制剂及其类似物,可据定量方法灵敏度与Km的相对大小选择测定抑制效力的方法;反应不可逆且可连续监测反应曲线时,在较低底物浓度下用简化积分法筛选抑制剂更便于常规实践。
第三部分以谷胱甘肽-S-转硫酶(glutathione-S-transferase,GST)为模型,考察用积分法测定有产物抑制的不可逆酶反应体系底物含量的可靠性,及积分法结合经典初速度法测定酶活性的可靠性。测定340am吸收监测反应。优化参数后此积分法所得产物最大吸收和酶活性对分析数据起止点的变化不敏感,且有很宽的线性响应范围。故只要获得不可逆酶反应体系积分速度方程和有效参数,有产物抑制时此积分法仍能用于动力学酶法分析和测定酶活性。积分法结合经典初速度法测定酶活性可有效拓展线性响应范围。用积分法进行动力学酶法分析方法效率高,成本低,抗干扰能力强,上限高于工具酶Km,甚至可高于仪器可测上限。此积分法用于酶法分析具有一定普遍性和应用价值。
第四部分以酵母醇脱氢酶(Dehydrogenases,ADH)为模型,考察用积分法测定有产物抑制且反应可逆体系底物含量的可靠性。用340nm吸收监测反应。人工智能建立反应体系最适稳态乙醛浓度与最大产物吸收关系用于约束稳态乙醛浓度分析ADH反应过程测定乙醇含量。此函数关系在测定精度允许范围内对酶活性变化、反应时间误差具有很好的抗性。此法测定乙醇含量成本比终点平衡法低,分析效率数倍于终点平衡法,线性范围超过了仪器的测定上限,且显著高于终点平衡法,抗干扰能力与终点平衡法相同。此动力学方法具有一定应用价值。