论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)的毒力因子和生物膜的形成均是导致APEC耐药性增加的重要因素,且抗生素的滥用也在一定程度上加重了APEC的耐药性。五味子作为我国重要的药用植物资源之一,在防治感染性疾病中展现出良好的治疗效果,其有效的抑菌成分为木脂素类物质,而五味子醇甲为其中代表性成分。近年来,中药有效成分可以在不影响细菌生长的情况下通过抑制细菌的毒力因子和生物膜形成起到抗感染作用,这种方式能够降低细菌生存压力,不易产生耐药性,被认为是更好地控制病原微生物感染的方式。但是五味子醇甲是否能够在不影响APEC生长的情况下通过抑制细菌的毒力因子、生物膜形成以及APEC引起的炎症反应起到抗APEC感染的作用,尚未见报道。因此,本研究采用五味子醇甲作为研究对象,首先在体外对五味子醇甲抗APEC的活性进行研究,确定其最小抑菌浓度。在此基础上,选择不抑制细菌生长的药物浓度,检测了五味子醇甲对APEC生物膜形成的作用。其次建立APEC感染鸡肺Ⅱ型上皮细胞模型和鸡肺损伤的动物模型,探究五味子醇甲是否减轻APEC感染所致炎性损伤,对宿主机体起到保护作用。详细试验内容及结果如下:首先通过琼脂稀释法测定了五味子醇甲对试验菌株APEC-O78的最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)为1600μg/mL,证实了五味子醇甲具有抑菌作用。接下来对五味子醇甲抑菌机理进行了研究。测定了五味子醇甲对APEC-O78生长曲线的影响,发现五味子醇甲作用于APEC-O78对数生长期,抑制APEC-O78的分裂。选择碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AKP)和胞外核酸在细菌胞外含量作为菌体细胞壁或者细胞膜是否受损的指标,测定出1/2MIC、MIC浓度的五味子醇甲处理APEC-O78后,AKP和胞外核酸含量显著增加。经由扫描电镜观察五味子醇甲作用于APEC-O78后,菌体表面的平滑结构被破坏,细菌呈现扭曲变形乃至凹陷,菌体出现裂解。以上结果表明五味子醇甲发挥抑菌作用是通过延缓APEC-O78的生长、破坏细胞壁和细胞膜的完整性来实现的。选择不影响APEC生长情况的五味子醇甲浓度(50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL),利用含有不同浓度琼脂的LB半固体培养基,观察五味子醇甲对APEC泳动及群集运动的影响,结果表明五味子醇甲能够抑制APEC-O78的运动能力。同时,利用结晶紫染色法对生物膜形成进行定量检测以及通过扫描电镜观察生物膜微观结构,发现五味子醇甲能够减少APEC-O78在接触载体表面的粘附,抑制APEC-O78生物膜形成。对APEC群体感应系统信号分子自体诱导物-2(Autoinducers-2,AI-2)含量进行检测,发现五味子醇甲抑制了APEC-O78的AI-2产生。通过RT-PCR检测五味子醇甲对生物膜相关基因的表达影响,结果表明五味子醇甲显著降低fliC、csgA、csgB、fimA、rpos、fyuA、iucD、H-NS、luxS、pfs、lsrK和lsrB等生物膜相关基因表达水平。以上结果提示五味子醇甲可以通过抑制生物膜的形成发挥抗APEC感染作用,降低细菌耐药性。前面结果已经表明五味子醇甲能够显著下调与黏附相关基因的mRNA水平。通过建立APEC-O78感染鸡肺Ⅱ型上皮细胞模型,首先检测到五味子醇甲能够降低APEC诱导的鸡肺Ⅱ型上皮细胞黏附数,与基因表达结果一致。同时,通过测定乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)含量反映细胞损伤程度,结果表明五味子醇甲能显著降低APEC-O78诱导的鸡肺Ⅱ型上皮细胞LDH的释放,这可能是通过抗APEC黏附实现的。通过ELISA法和RT-PCR法测定五味子醇甲对APEC-O78诱导鸡肺Ⅱ型上皮细胞分泌肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白细胞介素-(Interleukin-,IL-)1β、IL-6和IL-8的影响,结果表明五味子醇甲处理后,显著降低了APEC-O78诱导的鸡肺Ⅱ型上皮细胞炎性细胞因子的产生及mRNA表达水平,证实了五味子醇甲的抗炎作用。通过Western blot法研究了五味子醇甲的抗炎机制,结果显示五味子醇甲处理后,丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases,MAPKs)p38、JNK、核转移因子(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)p65和IκB的磷酸化水平显著降低,提示五味子醇甲发挥抗炎作用是通过抑制NF-κB和MAPK信号通路来实现。然后,通过构建APEC感染雏鸡所致肺损伤模型,从动物模型角度探究五味子醇甲减轻APEC所致肺损伤的分子机制。采用腹腔注射APEC-O78作为攻菌方式,1.8×10~9 CFU作为攻菌剂量,成功诱导鸡肺损伤模型。24 h后计算脏器菌载量,结果表明五味子醇甲能够显著减少心脏、肝脏、脾脏和肺脏的菌载量。收集肺组织以观察组织病理学变化,结果表明五味子醇甲显著减轻了APEC感染雏鸡所致肺组织病理损伤。通过湿/干比值判断肺组织水肿程度,发现五味子醇甲减轻了APEC-O78诱导的雏鸡肺组织水肿,且呈剂量依赖性。测定了肺组织丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,结果表明五味子醇甲能够显著减少MDA的产生,改善了肺组织的氧化状态。研究了五味子醇甲的抗炎作用及其机制,发现五味子醇甲显著降低肺组织MAPK p38、ERK、JNK、NF-κB p65和IκB的磷酸化水平,通过NF-κB和MAPK信号通路来抑制TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等炎症因子的产生。综上,本研究表明五味子醇甲在一定药物浓度下(>1600μg/mL)对APEC具有良好的抑菌活性。在不抑制APEC生长情况下,五味子醇甲能够抑制APEC生物膜的形成以及APEC引起的炎症反应,证明了五味子醇甲在减小细菌生存压力的同时,可以通过抑制APEC生理过程发挥抗感染作用。我们的研究将为今后APEC的研究提供理论依据,也为中药活性成分的研究提供新的思路,这将具有重要的借鉴意义。