论文部分内容阅读
本文选取鳞翅目夜蛾科昆虫一甜菜夜蛾作主要对象,系统研究了甜菜夜蛾胚胎的超低温保存技术及处理程序对胚胎发育,孵化幼虫的影响。此外,对斜纹夜蛾胚胎的超低温冷冻保存也作了初步研究。
作者研究了5种传统保护剂(二甲基亚砜,甘油,甲醇,1,3—丙二醇,乙二醇)和3种新型保护剂(2-氨基-1-乙二醇,3-氨基-1-丙醇及3-甲氧基-1,2-丙二醇)对甜菜夜蛾胚胎的毒性及其玻璃化能力,从中筛选出乙二醇作为保存甜菜夜蛾胚胎的低温保护剂。
发育50h的甜菜夜蛾卵,经14%次氯酸钠及正已烷去除外卵壳和蜡质层后,获得了99.8%的渗透率,70%左右的孵化率。利用乙二醇对去卵壳后的甜菜夜蛾胚胎进行三步法渗透(2mol/L EG, 5min→4mol/L EG, 5min8→ mol/LEG+5%PVP,30s),置入液氮冻存7min,37℃复温后于0.25mol/L的蔗糖溶液中稀释3min,覆盖石蜡油保湿孵化,可获得8.8%的孵化率。把三步渗透法第三步的乙二醇浓度提高到8.6M-9M,并延长渗透时间,不覆盖石蜡油进行保湿孵化,可以获得1.55-4.12%的孵化率。由以上程序冻存的胚胎所孵化幼虫,其外部形态及行为表现异常,即体色透明,行动缓慢,黑色素减少,不主动取食,48h内死亡。
深入研究表明,去卵壳处理过程不影响胚胎发育及孵化幼虫的生长发育,保护剂的渗透及在胚胎中的残余,诱导胚胎期酚氧化酶和初孵幼虫海藻糖酶活性的升高,基因组DNA去甲基化,初孵幼虫表皮的鞣化和硬化过程受阻,形成肿胀型幼虫,但是这些影响都可以修复,对孵化幼虫不造成致命性损伤。冻存及复温过程对胚胎发育的影响最大,基因组DNA去甲基化,气孔消失,表皮肿胀,中肠受损,其中复温过程中保护剂的反玻璃化及大冰晶的形成是造成孵化幼虫最终死亡的直接原因。
其它发育期的甜菜夜蛾卵对去卵壳及保护剂处理都极其敏感,液氮冻存后均无法孵化。改用天然饲料喂养甜菜夜蛾,虽然可以提高虫卵对保存程序的抗性,但冻存后也不能成功孵化。和甜菜夜蛾相比,发育至35h和50h的斜纹夜蛾胚胎对化学物质的处理更为敏感,胚体极易变形破裂,难以实现超低温种质保存。
实现一个物种的超低温保存是一项非常耗时的研究,本研究为以后研究奠定了基础,探明了昆虫胚胎超低温冻存程序的改良方向。