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第一部分:BM-MSCs参与慢性幽门螺杆菌感染相关胃癌血管生成目的:胃癌目前是世界上第五大确诊的恶性肿瘤,也是全球第三大常见癌症的死亡原因。很多因素促进胃癌的发生和进展,其中幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,H.pylori）感染是胃癌发生的主要原因。骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BM-MSCs）已被证明可以在慢性H.pylori感染时,可以被招募到胃癌中并促进肿瘤生长。有研究表明BM-MSCs具有促进肿瘤血管生成的作用,但是BM-MSCs在慢性H.pylori感染相关胃癌中是否具有促进肿瘤血管生成作用仍不明确。本实验旨在研究BM-MSCs在慢性H.pylori感染相关胃癌中对血管生成的作用。方法:小鼠接受致死辐照后,建立LSL-tdtomato荧光标记的全骨髓移植（Total bone marrow transplantations,BMT）小鼠模型,然后将小鼠感染H.pylori 3月,构建BMT+慢性H.pylori感染小鼠模型,然后处死小鼠,HE染色分析胃组织病理情况,共聚焦显微镜观察LSL-tdtomato荧光标记的骨髓源性细胞在胃内分布情况。建立慢性H.pylori感染小鼠模型,从BALB/c小鼠的骨髓中分离并纯化、培养和鉴定BM-MSCs,然后构建慢性H.pylori感染+绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein,GFP）标记BMMSCs胃浆膜层移植小鼠模型,分组如下正常对照组（Control组）,慢性H.pylori感染组,慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植组,单纯BM-MSCs移植组。移植3月后处死小鼠,共聚焦显微镜观察GFP标记BM-MSCs在胃内分布情况,苏木素伊红染色（Hematoxylin and eosin staining,HE）分析胃组织病理情况。免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）、免疫组织荧光（Immunofluorescence,IF）检测显示血管源性标志物血小板-内皮细胞粘附分子1（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1,CD31）、NG2蛋白聚糖（NG2 proteoglycan,NG2）、层粘连蛋白-1（LAMININ-1）、血管性血友病因子（von Willebrand factor,VWF）在不同组小鼠胃组织中表达情况。结果:1.BMT+慢性H.pylori感染小鼠模型中,共聚焦显微镜观察显示胃内可见LSLtdtomato标记的骨髓源性细胞分布在胃黏膜层和黏膜下层,HE染色显示在BMT+慢性H.pylori感染小鼠中,小鼠胃黏膜可见上皮内瘤变,未见明显肿瘤。2.慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植模型中,GFP荧光显示,在慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植组,GFP标记的BM-MSCs分布在小鼠黏膜层和黏膜下层。HE染色显示与单纯慢性H.pylori感染组相比,慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植组小鼠发生上皮内瘤变和胃癌的比例都明显增加。3.慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植模型中,IHC和IF检测血管源性标志物显示,与单纯慢性H.pylori感染组相比,慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植组小鼠血管源性标志物明显增多。结论:在慢性H.pylori感染微环境下,BM-MSCs会向着胃内迁移定植,促进H.pylori感染小鼠发生上皮内瘤变和胃癌,并且促进血管生成增多。第二部分:H.pylori预处理的BM-MSCs体内外促进胃癌血管生成目的:前面的研究中我们发现在慢性H.pylori感染微环境下,BM-MSCs会向着胃内迁移定植,促进胃癌生成和血管生成增多。但BM-MSCs本身对胃癌血管生成的直接作用依然是未知的,因此本实验的目的是为了明确BM-MSCs对胃癌血管生成的作用。方法:体外建立胃癌细胞SGC7901（SGC）和人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）的共培养体系,观察BM-MSC条件培养基对胃癌微环境下HUVEC增殖、迁移、凋亡、粘附、小管形成等的影响。使用H.pylori上清干预BM-MSCs,观察干预前后BM-MSCs条件培养基对HUVEC作用的变化。使用鸡胚绒毛尿囊膜模型（Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM）,建立BM-MSCs+胃癌细胞混合移植CAM模型,观察BM-MSCs对胃癌细胞CAM血管生成的影响。使用裸鼠皮下移植瘤模型,建立BM-MSCs+胃癌细胞混合皮下移植瘤模型,观察BM-MSCs对胃癌细胞裸鼠皮下移植瘤生长曲线、体重、HE染色、Ki67染色、CD31染色以及肿瘤血管特异性活体成像的影响。使用H.pylori上清干预BM-MSCs,观察干预前后BM-MSCs对胃癌血管生成的变化。结果:1.在SGC与HUVEC共培养体系中,BM-MSCs条件培养基促进HUVEC增殖、粘附、迁移和小管形成,减少凋亡,H.pylori上清干预增强BM-MSCs的这些作用。2.在CAM模型中,与单纯胃癌组相比,BM-MSCs+胃癌细胞混合组形成的血管密度大于单纯胃癌细胞组,H.pylori上清预处理的BM-MSCs+胃癌细胞混合组,形成血管密度更多。3.在裸鼠皮下移植瘤模型中,与单纯SGC组相比,BM-MSCs+SGC混合成瘤组形成的瘤体更大,生长更快,增殖指数更高,形成的新生血管更多。H.pylori上清预处理的BMMSCs+SGC混合成瘤组的促进胃癌血管生成作用更强。结论:BM-MSCs体外能促进内皮细胞增殖、迁移、粘附和小管形成,H.pylori上清预处理能增强BM-MSCs的体外促进内皮细胞增殖、迁移、粘附和小管形成能力。BM-MSCs体内能促进胃癌细胞引起的血管生成,H.pylori上清预处理能增强BM-MSCs的体内促进胃癌血管生成能力。第三部分:THBS4/整合素α2轴介导BM-MSCs促进慢性幽门螺杆菌感染相关胃癌血管生成目的:通过前面的研究我们确定了BM-MSCs促进慢性H.pylori感染相关胃癌血管生成,但是其具体的机制不明。本实验的目的是为了进一步明确BM-MSCs参与慢性幽门螺杆菌感染相关胃癌血管生成的具体作用机制。方法:1.通过RNA测序技术（RNA Sequencing,RNA-Seq）分析BM-MSCs移植后对慢性H.pylori感染小鼠引起的差异基因表达变化并且进行了富集分析。筛选出BM-MSCs对慢性H.pylori感染相关血管生成的差异基因。2.通过实时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）对筛选出的差异基因进行RNA水平的验证,筛选出表达最高最稳定的基因。3.使用Western Blot技术对筛选出的基因进行蛋白水平的验证。4.使用IHC、IF验证移植BM-MSCs后该差异基因的表达变化。5.使用Western Blot分析H.pylori干预对BM-MSCs中该基因表达的影响。6.构建慢病毒介导的干扰短发夹RNA（Short hairpin RNA,sh RNA）进一步在HUVEC共培养体系、CAM模型、皮下移植瘤模型中以及慢性H.pylori感染+BM-MSCs移植模型中分析干扰该靶点后对胃癌血管生成的进一步影响。结果:1.RNA-Seq结果显示:BM-MSCs移植到慢性H.pylori感染小鼠引起很多差异基因表达变化。2.使用富集分析筛选出跟血管生成可能相关的基因。应用RT-PCR及Western Blot验证发现,在这些基因中THBS4升高最多且稳定。3.IHC及IF验证发现在BM-MSCs移植后的慢性H.pylori感染小鼠胃中,THBS4表达增加。4.Western Blot显示H.pylori上清干预增加BM-MSCs中THBS4表达。5.在HUVEC共培养体系和CAM模型、皮下移植瘤模型中,使用sh RNA敲低BM-MSCs中THBS4的表达后,其促进血管生成的能力降低。6.将敲低THBS4的BM-MSCs移植到慢性H.pylori感染的小鼠中,其促进血管生成能力降低。7.重组人血小板反应蛋白（Recombinant human thrombospondin 4,r THBS4）能够激活内皮细胞上整合素ɑ2（Integrinα2,α2）受体。8.ɑ2受体特异性中和抗体可以减轻THBS4诱导的促进HUVEC小管形成和迁移作用。结论:BM-MSCs通过THBS4/整合素ɑ2受体轴促进慢性幽门螺杆菌感染相关胃癌血管生成第四部分:抑制PI3K/AKT信号通路可抑制THBS4/整合素ɑ2受体轴诱导的血管生成目的:本部分实验目的是为了进一步探索THBS4/整合素ɑ2受体轴对内皮细胞具体作用机制。方法:通过Western Blot技术检测THBS4/整合素ɑ2受体轴对HUVEC中下游信号通路的关键分子的影响,使用PI3K抑制剂LY294002抑制PI3K信号通路然后并检测。Transwell和小管成型实验检测PI3K抑制剂LY294002对r THBS4诱导的体外血管生成的影响。构造r THBS4和胃癌细胞混合皮下移植瘤模型,再予以LY294002腹腔注射,探索LY294002对肿瘤形成和血管生成的影响。结果:Western Blot检测显示,r THBS4能上调HUVEC细胞中的P13K/AKT信号通路,PI3K信号通路抑制剂LY294002能抑制其上调的P13K/AKT信号通路中的关键分子的表达。Transwell和小管成型实验显示抑制P13K/AKT信号通路能在体外降低r THBS4诱导的血管生成。应用裸鼠胃癌皮下移植瘤模型发现P13K通路抑制剂能下调r THBS4诱导的胃癌血管生成。结论:抑制PI3K/AKT信号通路可部分抵消THBS4诱导的胃癌血管生成。