论文部分内容阅读
目的:骨癌痛（Bone Cancer Pain,BCP）是一种常见于晚期癌症患者的缺乏有效治疗手段的中重度慢性疼痛。钩吻素子（Koumine）作为一种具有镇痛抗炎效应且广泛应用于民间的钩吻类生物碱,其对神经病理性疼痛的镇痛作用机制已有较为广泛的研究,然而其在BCP中的镇痛效能及作用机制研究尚不清楚。因此,本研究拟通过鞘内注射钩吻素子来评估其对小鼠BCP的镇痛作用及其可能的作用机制。本研究分为两个部分,第一部分,探讨BCP小鼠的脊髓中PI3K/Akt信号通路、小胶质细胞和炎症因子表达的变化;第二部分,探讨鞘内注射钩吻素子对BCP小鼠的痛行为学以及脊髓PI3K/Akt信号通路、小胶质细胞和炎症因子表达的影响。方法:第一部分实验:（1）雄性SPF级C57BL/6小鼠88只,随机分为假手术组（Sham组）和骨癌痛组（BCP组）两组（N=44只）,将2×10~5个Lewis肺癌（Lewis Lung Cancer,LLC）细胞（10μl）推注到右股骨骨髓腔,从而建立BCP模型,Sham组则推注等体积磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline,PBS）。其中每组中随机选取8只小鼠仅用于测痛,分别在接种LLC细胞前1天（T0）,以及接种后第3天（T1）、第7天（T2）、第10天（T3）、第14天（T4）、第21天（T5）测定痛行为学,含机械缩足阈值（Paw Withdrawal Mechnical Threshold,PWMT）以及热缩足潜伏期（Paw Withdraw Threshold Latency,PWTL）。并分别在T2、4、5时点测痛后随机处死12只小鼠,取小鼠脊髓腰膨大处,采用免疫印迹（Western Blot,WB）法检测各时点p-PI3K/PI3K、p-Akt/AKT、Iba1、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白介素1β（Interleukin-1β,IL-1β）蛋白的表达。免疫荧光法检测脊髓p-PI3K、p-Akt、Iba1的表达。取小鼠右下肢行病理组织学检查。（2）SPF级雄性C57BL/6小鼠72只,采用随机数表法分为4组（N=18只）:假手术组+Vehicle（Sham+Vehicle组）、骨癌痛组（BCP组）、骨癌痛+LY294002组（LY294002组）、骨癌痛+溶剂组（BCP+Vehicle组）。LY294002组或BCP+Vehicle组分别于接种LLC细胞后第14～16天分别鞘内注射LY2940025μg/5μl或Vehicle 5μl。每组固定6只小鼠于第14～16天给药后1h进行痛行为学测定,各组于第16天1h时取12只小鼠处死,取小鼠脊髓腰膨大处,采用WB法检测脊髓水平p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白的表达,免疫荧光法检测脊髓p-Akt、Iba1的表达。第二部分实验:SPF级雄性C57BL/6小鼠72只,采用随机数表法分为4组（N=18只）:假手术组+Vehicle（Sham+Vehicle组）、骨癌痛组（BCP组）、骨癌痛+钩吻素子组（Koumine组）、骨癌痛+溶剂组（BCP+Vehicle组）。Koumine组及BCP+Vehicle组分别于接种LLC细胞后第14天分别鞘内注射钩吻素子30μg/10μl及Vehicle 10μl。每组固定6只小鼠于给药后第30、60、90、120、150、180min进行痛行为学测定,各组于1h时随机取12只小鼠处死,取小鼠脊髓腰膨大处,分别采用WB法检测脊髓水平p-PI3K、p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白的表达,免疫荧光法检测脊髓p-PI3K、p-Akt、Iba1的表达。结果:第一部分实验:（1）在接种LLC细胞后第0天和第3天,BCP组小鼠和Sham组小鼠的PWMT和PWTL无明显差异。然而,在推注LLC细胞后的T2-5时点,与Sham组小鼠相比,BCP组小鼠的PWMT和PWTL均显著降低（P＜0.05）;与Sham组小鼠相比,BCP组在推注LLC细胞后第7、14、21天,脊髓p-PI3K、p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白的表达水平均升高,同时,p-PI3K、p-Akt、Iba1的免疫荧光阳性面积均显著增加（P＜0.05）。Sham组小鼠骨质无破坏,无肿瘤细胞浸润;BCP组小鼠骨质破坏,大量LLC细胞浸润。（2）与BCP组相比,LY294002组小鼠的痛行为学均有明显的缓解。与BCP组及BCP+Vehicle组相比,LY294002组小鼠脊髓p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白的表达水平均下降,同时p-Akt、Iba-1的免疫荧光阳性面积均显著减少（P＜0.05）。第二部分实验:与BCP组相比,Koumine组在鞘内给药第60 min时PWMT和PWTL均显著增加。与Sham+Vehicle组相比,BCP组和BCP+Vehicle组p-PI3K、p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）,与BCP组和BCP+Vehicle组相比,Koumine组p-PI3K、p-Akt、Iba1、IL-6、IL-1β蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。与BCP组和BCP+Vehicle组相比,Koumine组小鼠脊髓背角（Spinal Cord Dorsal Horn,SDH）中p-PI3K、p-Akt、Iba1免疫荧光阳性面积均显著减小（P＜0.05）。结论:（1）脊髓PI3K/Akt信号通路可能参与了BCP小鼠脊髓的小胶质细胞活化,从而释放大量炎症因子,产生和维持BCP;（2）鞘内注射钩吻素子能够通过抑制PI3K/AKT信号通路,减轻小胶质细胞活化,减少炎症因子释放,从而缓解BCP。