组织因子(TF)作为凝血途径的始动因子以为人所熟知。在血管损伤后,TF和凝血因子Ⅶa (FVIIa)形成复合物激活凝血蛋白酶的瀑布反应,导致纤维蛋白沉积和血小板的活化。另外,在许多疾病如败血症,动脉粥样硬化和肿瘤,血管中TF的异常表达会引起致命的血栓形成。近年来研究表明,血管中的TF在产生凝血蛋白酶和后续激活蛋白酶激活受体(PARS)中也发挥着非止血作用。这些TF依赖性的信号通路促进了一系列生物进程,包括炎症,肿瘤转移和细胞迁移。本课题组前期研究的EGFP-EGF1蛋白具有TF特异性和高度的亲和力,且将其连接于聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒(PLGA)纳米粒表面后构建的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒也具有TF靶向性。小干扰RNAs (siRNA)通过完全互补的RNA诱导沉默复合体(RISC)介导特异性切割,并有针对性的破坏靶基因的mRNA,从而产生靶基因的mRNA序列特异基因沉默效应。它们己被证明能有效下调人类细胞中的基因表达,从而具有治疗疾病的潜力。然而,siRNA分子本身带负电荷,易于被血清中的核酸酶降解,容易被肾脏清除,并无靶向分布能力,这些都导致它难以到达作用的靶细胞。它的应用受到如稳定性差,半衰期短,和沉默效率低等许多限制。因此,siRNA作为RNA干扰(RNAi)的一种手段,其治疗最为主要的障碍是缺乏有效的递送系统。病毒递送系统如慢病毒、腺病毒,可有较高的转染效率,但由于其致突变性,载药量有限,以及引起炎症反应和免疫应答等安全隐患而受到限制。因此,直接的系统性的非病毒载体是siRNA的最佳选择,该载体应具有运载核酸类分子如基因,siRNAs,或反义RNA等进入细胞的能力。非病毒递送系统包括siRNA的化学修饰,脂质体,纳米粒,多肽和靶向递送。随着合成材料和纳米技术的发展,可以合成具有特殊功能的纳米材料。其在生物学领域的应用变得普遍。纳米材料因其具有低毒性,良好的生物降解性和生物相容性,而被用作转染载体,如壳聚糖,聚乙烯亚胺(PEI),聚乳酸—聚羟基乙酸(PLGA),磁性纳米粒和纳米碳管等。因为可以抵抗高核酸酶并具有粘膜粘附特性,使得它们成为siRNA重要的载体。靶向RNAi治疗是一个相对新的研究领域,它可以满足体内递送要求的选择靶向性。靶向病变细胞,器官或组织可以提高一定siRNA剂量下的基因沉默效率。特异性的细胞靶向功能还可以抑制siRNA对非病变细胞造成的副作用。通过具有高度特异性和亲和力的抗体,短肽和其他配体连接于载体表面可以介导siRNA到达靶向组织和细胞。前期研究采用复乳法制备的EGFP-EGF1-PLGA纳米粒,适合包载水溶性的基因药物。它不仅对包载的药物具有保护作用,还可将其靶向递送至病变组织或细胞。鉴于上述基础,本研究将利用该纳米粒作siRNA或shRNA的载体,靶向递送至病变细胞,发挥基因沉默效应。由于前期的研究都是基于大鼠模型的疾病进行,而有些疾病模型在小鼠中更为经典,为了拓宽该纳米粒的应用范围,本研究还验证了ENP在小鼠高表达TF的疾病模型(动脉粥样硬化模型)中的靶向性。第一部分载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的构建及表征目的筛选出有效的大鼠组织因子特异性的siRNA片段(TF-siRNA);将该片段载入EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒(PEG-PLGA)中,并对该纳米粒的性质进行鉴定。方法选择大鼠胶质瘤细胞系C6来筛选siRNA片段,细胞表面天然表达TF,通过传统转染试剂lipo2000转染细胞,进行实时定量PCR (Q-PCR)和western-blot检测细胞组织因子的mRNA和蛋白水平改变,进而筛选出最佳的TF-siRNA片段。采用复乳法,合成出包载TF-siRNA的PLGA纳米粒(TF-siRNA-NP),之后将EGFP-EGF1蛋白巯基化,连接于TF-siRNA-NP表面,合成出TF-siRNA-ENP。通过粒径/Zeta电位测定仪对纳米粒的粒径和Zeta电位进行测定。通过普通电镜观察纳米粒的形态,并通过免疫电镜观察纳米粒表面连接的蛋白。提取纳米粒中的siRNA计算siRNA的载药量和包封率。通过体外释放实验计算出siRNA的释放量。结果siRNA-638片段为大鼠组织因子最佳沉默片段。载入TF-siRNA的ENP(TF-siRNA-ENP)粒径大小约100nm左右,外观大小均一、圆整。Zeta电位为-11mV左右。免疫电镜结果证实纳米粒表面连接有EGFP-EGF1蛋白。TF-siRNA的包封率约81.33%。体外不同pH环境中siRNA的释放无明显差异,6小时内快速释放约42%。结论TF-siRNA-ENP粒径大小,EGFP-EGF1蛋白的成功连接,siRNA的载药量和体外的快速释放都可满足后续实验需求。第二部分载组织因子siRNA的EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的靶向性及体外评价目的验证TF-siRNA-ENP对损伤的脑微血管内皮细胞(BMECs)的靶向性。评价TF-siRNA-ENP对肿瘤坏死因子a (TNFa)诱导的BMECs损伤过程中,组织因子表达和组织因子活性的抑制效果。评价该纳米粒的细胞毒性。方法两次消化加Percoll梯度离心法提取大鼠BMECs, TNFa诱导BMECs的损伤,建立损伤的微血管内皮细胞模型。在ENP纳米粒表面连接香豆素-6示踪纳米粒,测定其载药量等性质,并进行细胞摄取实验；同时用对siRNA进行标记,在BMECs中示踪siRNA。转染TF-siRNA-ENP进入诱导的BMECs,通过实时定量PCR, western-blot,和流式检测TF表达水平的改变。并通过TF活性检测评价其对细胞TF活性的影响。CCK-8法检测纳米粒的细胞毒性。结果TNFa诱导损伤的BMECs可以高表达TF。TF-siRNA-ENP可以更好的被损伤BMECs摄取,介导siRNA进入细胞内。有效下调损伤过程中细胞TF mRNA和蛋白的表达水平。并能有效降低细胞TF的活性。在有效作用剂量下TF-siRNA-ENP对细胞活性无影响,较lipo2000明显优势。结论TF-siRNA-ENP是TF-siRNA靶向递送至损伤内皮细胞的一个有效递送系统。它的细胞安全性好,基因沉默效率高。第三部分EGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒在动脉粥样硬化模型中靶向性的研究目的验证EGFP-EGF1-PLGA纳米粒(ENP)对小鼠动脉粥样硬化模型(AS模型)的靶向性。方法通过复乳法,分别构建载香豆素-6和Dir的ENP纳米粒。分别测定他们的载药量。用单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)诱导原代小鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs),用氧化低密度脂蛋白(oxLDL)诱导小鼠单核巨噬细胞(Raw264.7)分别构建体外高表达TF的动脉粥样硬化细胞模型。高脂伺料持续14周喂养ApoE基因敲除小鼠(ApoE-/-),建立小鼠动脉粥样硬化模型。细胞摄取载香豆素-6纳米粒的实验,通过荧光显微镜和流式细胞学检测细胞内的荧光强度,判断其细胞靶向性。通过油红0染色和血清胆固醇脂的测定来验证AS动物模型中粥样硬化斑块的形成。载Dir的纳米粒进行器官成像实验,观察其体内分布；同时进行冰冻切片,激光共聚焦直接观察纳米粒在病变血管中的分布。结果两种细胞经过诱导后建立的细胞模型,均可高表达TF。ENP纳米粒可以更好的被模型细胞所摄取。与不连接EGFP-EGF1蛋白的纳米粒之间的差异具有统计学意义。高脂饮食喂养14周的ApoE-／-小鼠血清胆固醇脂明显升高,主动脉血管切片中可见内膜增厚和脂质斑块的沉积。器官成像结果显示AS模型中,斑块区域可更好的摄取ENP纳米粒。切片结果显示ENP在血管中多分布在高表达TF的部位,并可以部分与斑块区域重合。结论ENP具有小鼠AS模型的靶向性。第四部分载CCR2-shRNA的IGFP-EGF1蛋白结合聚乙二醇—聚乳酸—聚羟基乙酸纳米粒的体外研究目的在体外验证载CC趋化因子2特异性shRNA (CCR2-shRNA)的ENP (CCR2-shRNA-ENP)可以有效下调AS细胞模型的CCR2表达,并抑制细胞的迁移能力。方法通过双重免疫荧光法和实时定量PCR检测AS模型小鼠主动脉内CCR2和TF的表达情况。通过实时定量PCR,选择诱导剂MCP-1和oxLDL最佳的作用浓度及作用时间点,构建体外同时高表达TF和CCR2的AS细胞模型。诱导后的细胞给予CCR2-shRNA-ENP干预,通过实时定量PCR和western-blot测定细胞CCR2表达水平的改变。同时用CCK-8法评价CCR2-shRNA-ENP的细胞毒性。转染CCR2-shRNA-ENP的细胞,分别进行细胞迁移实验,评价其对这两种细胞迁移能力的改变。结果AS模型小鼠主动脉内高表达TF和CCR2,在14周时两者表达都处于高位。通过Q-PCR结果选择MCP-1以10ng/ml作用于VSMCs2h, oxLDL以50μg/ml作用于Raw264.71h,来构建细胞模型。转染CCR2-shRNA-ENP后的模型细胞CCR2表达在mRNA和蛋白水平都有明显下降。且不影响细胞活性。同时,细胞的迁移能力也有明显降低。结论CCR2-shRNA-ENP可以作为有效的CCR2-shRNA靶向运载系统。运载CCR2-shRNA到AS细胞模型中,发挥基因沉默效应,并有效抑制模型细胞的迁移。为后续的动物实验打下基础。