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本研究以紫花苜蓿(Medicago sativa L.)为试验对象,系统地研究了紫花苜蓿生长过程中对不同盐碱胁迫的响应,对紫花苜蓿组织培养技术以及耐盐碱特异性基因芯片技术、相关的转基因苜蓿转化体系的建立进行了初步探索,培育一批耐盐碱苜蓿后代材料,为苜蓿耐盐碱机理研究和重度盐碱化退化草地生态恢复与重建提供相关的科学依据。
试验采用5种不同浓度的盐碱溶液对紫花苜蓿幼苗进行胁迫培养,实验结果表明,在盐碱胁迫下,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、氧化氢酶(CAT)的含量随着盐碱的增加和处理时间的延长,其含量逐渐增加;当处理浓度大于200mmolL-1时,超过苜蓿细胞膜的承受极限,膜脂质过氧化作用加剧。随着丙二醛(MDA)积累增加,苜蓿细胞的正常代谢受到破坏。苗期苜蓿的干物质积累越多,表明苜蓿的耐盐性越强。因此,苜蓿苗期的干重对于反映苜蓿的耐盐碱性比较可靠,其他生理指标(包括脯氨酸含量、可溶性糖含量、自由水、束缚水含量,叶片保水力等)也有一定的参考意义。
以其无菌苗叶片为外植体,采用不同盐碱胁迫浓度培养基的组合和激素配比进行组织培养,研究表明: MS+2,4-D0.5mg·L-1+6-BA0.1mg·L-1+KT0.5mg·L-1为紫花苜蓿愈伤组织最优诱导培养基;观察了胚性愈伤组织的诱导、继代和分化,建立一套耐盐碱基因型的苜蓿体细胞胚发生体系,大幅度提高了体细胞胚发生率。在盐碱胁迫下,通过组织培养再生系统对一些耐盐碱紫花苜蓿品种进行了筛选。
在盐碱胁迫下培养紫花苜蓿幼苗,提取cDNA基因芯片,通过上调、下调基因分析,得出耐盐碱的特异性基因。相关功能性的基因可大致分为胁迫反应、转运、信号转导、未知蛋白和假象蛋白等。在上调表达基因中,胁迫反应作用类占1.82%。
鉴于紫花苜蓿公农1号体细胞胚发生重复性好,以其为受体基因型,以HAL1基因为目的基因,建立了农杆菌介导苜蓿转基因程序,建立了试管苗叶片耐盐碱筛选结合分子生物学检测体系,最终建立了适合基因型范围较广、转化效率较高的转化系统,培养出耐盐碱型1代转基因苜蓿品种,为以后开展苜蓿耐盐碱转基因产业化研究打下良好基础。