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近年来,随着人们生活节奏加快、环境污染、饮食结构变化,肿瘤疾病的发病率在逐年增加。因此,治疗肿瘤的药物研发具有重要意义。在肿瘤治疗领域中,寡核苷酸类药物(Antisense oligonucleotide,AS-ODN)类药物及相关治疗技术进入了大家的视野并得到极大重视。寡核苷酸是一类重要的特异性基因表达物质,包括小干扰RNA和反义寡核甘酸等,目前由于存在着稳定性差、较高负电荷、跨膜能力弱、易被核酸酶降解等问题,限制了研究发展。LOR-2501是一种含有20个碱基的AS-ODN,因为能够与核糖核苷酸还原酶(Ribonucleotide reductase,RNR)大亚基R1的mRNA编码区互补,具有一定的抗肿瘤活性。靶向survivin基因的2′-甲氧基修饰的siRNA可以有效抑制survivin蛋白的表达,从而抑制了肿瘤细胞的增殖。本文针对寡核苷酸存在的问题,首先合成了一种新型的阳离子材料-硬脂酸修饰的八聚精氨酸(Sta-R8),该材料既保留了八聚精氨酸的细胞穿透性,修饰后又具有两亲性可自包封形成纳米载体,进一步提高其稳定性及转染特性;然后以Sta-R8作为基质材料制备阳离子脂质体传递系统(SLP),制备得到的脂质体与游离穿膜肽相比,毒性减小,稳定性好;并且采用SLP装载反义寡核苷酸及小干扰核糖核酸(siRNA),结果显示作为这两种载药系统均能够高效的传递核苷酸进入肿瘤细胞;最后为了提高SLP的靶向性,本文制备了具有肿瘤特异性靶向配体-转铁蛋白(Tf)修饰的Tf-SLP并装载siRNA,结果显示Tf-SLP能有效传递靶向Survivin基因的siRNA进入肿瘤细胞,并且对Tf高表达的肿瘤细胞具有靶向作用。本论文研究的具体内容概括如下:1.StA-R8的合成及传递系统的建立本文首先在R8的基础上,合成改性穿膜肽StA-R8。采用乙醇注入法制备了StA-R8脂质体传递系统(SLP)。对SLP传递系统的制备工艺进行优化并对其稳定性进行考察。制备的最优条件是选择HEPES(pH=7.4),StA-R8、胆固醇、蛋黄卵磷脂的摩尔比在20/35/45时制备得到的脂质体粒径为126.4±6.2 nm,zeta电位值为18.3±1.3mV。StA-R8对He La和A549细胞细胞毒性较低,SLP的细胞毒性更低,细胞活力均在80%以上。在25天内,SLP传递系统的粒径略微增加,但变化不大,而zeta电位值无明显变化。2.StA-R8脂质体/LOR传递系统的建立和评价为评价制备的SLP载体系统的转染效率,本文选择LOR进行装载和递送,LOR是一种AS-ODN类药物,具有抗肿瘤活性。首先以粒径和zeta电位作为考察指标,结果显示,脂质体当N/P达到6以后,SLP与LOR形成的纳米粒子粒径基本无明显变化,电位数值在N/P比变化的过程中呈现由负到正的趋势,说明了随着阳离子脂质体量的增加,能够与LOR结合。在体外细胞评价实验中,通过MTT实验考察SLP/LOR的肿瘤细胞抑制效果,结果显示抑制率超过30%;通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察考察细胞摄取情况,结果显示SLP能够将LOR大量递送进肿瘤细胞,具有较好的转染效果。采用RT-PCR法测定R1mRNA,结果显示其在Hep G2细胞中对R1 mRNA的下调效率为39.1%。与StA-R8相比提高了19.2%。采用Western-blot法测定R1蛋白表达量,结果显示,SLP组的R1蛋白下调效率明显高于StA-R8组。3.StA-R8脂质体/siRNA传递系统的建立和评价本文同时对改性多聚精氨酸制备的阳离子脂质体装载一种靶向survivin基因的siRNA,并对其性质进行评价。首先对SLP/si RNA的N/P比进行优化,以粒径和电位作为指标,结果表明当N/P≥6时,可形成稳定的纳米粒子。琼脂糖凝胶电泳试验得到SLP在N/P比大于6时,SLP与siRNA完全结合。同时对SLP与siRNA形成的纳米粒子进行体外细胞实验研究。通过MTT实验考察SLP/si RNA的肿瘤细胞抑制效果,结果显示抑制率超过35%;通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察考察细胞摄取情况,结果显示SLP能够高效地将siRNA递送进肿瘤细胞,具有较好的转染效果。采用Western-blot法测定survivin蛋白表达量,结果显示,SLP组的survivin蛋白下调效率明显高于StA-R8组,说明了SLP能够将siRNA转染进入细胞,干扰survivin蛋白的合成过程,抑制肿瘤细胞的生长。4.Tf/StA-R8脂质体传递siRNA系统的建立和评价本文在制备的SLP的基础上,采用后插入法,将Tf-PEG-DSPE后插入到脂质体中,形成转铁蛋白修饰的脂质体传递系统(TLSP)。制备的TLSP结构包括外层具有肿瘤靶向性的转铁蛋白配体,延长血液循环时间的PEG结构,在磷脂层中能够协助传递系统穿透细胞膜的改性穿膜肽StA-R8,从而提高siRNA内化进入肿瘤细胞的效率。稳定性试验表明后插入法制备的转铁蛋白修饰的脂质体具有较好的稳定性。TSLP/siRNA的粒径和电位与不含靶向配体的脂质体相比均发生了改变,粒径增加至148.7±11.95 nm,粒度分布均一,电位为4.7±0.2 mV。TSLP作为载体和SLP一样,具有低的细胞毒性。通过流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察考察细胞摄取情况,结果显示与脂质体相比,TSLP能够更高效地递送siRNA进入肿瘤细胞。采用Western-blot法测定survivin蛋白表达量,结果显示,SLP/si RNA和TSLP/siRNA组的蛋白表达量分别为44.1%和20.4%。使用TSLP作为载体转染survivn siRNA更加高效。综上所述,本文中制备的改性多聚精氨酸脂质体及其Tf修饰的载药系统具有细胞毒性低、稳定性好的特点,并且能够与寡核苷酸结合形成稳定的体系,高效递送寡核苷酸类药物进入肿瘤细胞,为今后进一步体内研究等工作打下坚实地基础。