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目的:
microRNA(miRNA)是一类长度约为19-26个核苷酸的内源性、非编码的小分子RNA,microRNA通过结合靶mRNA的3’端非编码区(3’UTR)来抑制基因的表达。研究发现,miRNA在肿瘤的增殖和凋亡等过程中发挥着非常重要的作用,然而有关miRNA在葡萄膜黑色素瘤中的功能仅有少数相关报道。本研究旨在探讨microRNA-199a*(miR-199a*)在人眼葡萄膜黑色素瘤细胞中的表达、功能以及作用机制。
方法:体外培养正常的人眼葡萄膜黑色素细胞Um95和葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5。
(1)采用Real-timePCR技术检测miR-199a*在Um95、M17、M23和SP6.5中的表达情况;
(2)采用阳离子Liprofectamine介导的基因转染技术,在M17、M23和SP6.5中转染miR-199a*,使其在葡萄膜黑色素瘤细胞中过表达;
(3)用CY3荧光标记的随机序列小分子RNA进行转染效率检测;
(4)采用MTS方法检测miR-199a*对葡萄膜黑色素瘤细胞增殖能力的影响;
(5)通过平板克隆形成实验观察转染miR-199a*后,葡萄膜黑色素瘤细胞克隆形成的能力;
(6)流式细胞仪技术检测miR-199a*对葡萄膜黑色素瘤细胞周期的影响;
(7)采用Hoechst染色法、Annexin-V法、Tunel染色法、Caspase-3/7活性检测法检测转染miR-199a*后,对葡萄膜黑色素瘤细胞凋亡的影响;
(8)采用荧光素酶报告基因分析的方法确定miR-199a*的靶基因c-Met;
(9)采用Westernblot方法检测靶基因编码蛋白的表达,以及细胞增殖、凋亡相关信号蛋白的表达;
(10)采用RNAi技术干扰靶基因的表达,通过MTS方法、流式细胞仪技术,Caspase-3/7活性检测法,检测对葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖、凋亡的影响。
结果:
(1)Real-timePCR结果显示:miR-199a*在正常的葡萄膜黑色素细胞Um95中高表达,而在葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5中的表达显著降低(P<0.01);
(2)转染效率检测结果显示:小分子RNA的转染效率几乎达到100%;
(3)MTS结果显示:转染miR-199a*后,葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5的增殖能力受到明显抑制(P<0.01);
(4)转染miR-199a*后,葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5的克隆形成能力明显降低;
(5)转染miR-199a*后,葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5的细胞周期在G1期出现滞留现象;
(6)miR-199a*的导入,诱发了葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5的凋亡;
(7)荧光素酶报告基因分析法结果显示,c-Met是miR-199a*的靶基因;
(8)Westernblot结果显示:转染miR-199a*后,葡萄膜黑色素瘤细胞M17、M23和SP6.5中,c-Met蛋白表达量明显下降;c-Met下游信号通路蛋白p-ERK、p-Akt以及细胞周期相关蛋白p-Rb、E2F1、p-cdc2的表达都有不同程度的下调;细胞凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-9、p53的表达出现不同程度的活化或者上调;
(9)采用RNAi技术抑制靶基因c-Met的表达后,MTS、流式细胞仪技术检测结果显示:葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖受到明显抑制(P<0.01),细胞周期在G1期出现滞留现象;而Caspase-3/7活性检测结果显示:下调靶基因c-Met的表达,并未显著影响葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡。
结论:
miR-199a*在正常的葡萄膜黑色素细胞中高表达,而在葡萄膜黑色素瘤细胞中表达显著降低。在人眼葡萄膜黑色素瘤细胞中转染miR-199a*之后,可以抑制葡萄膜黑色素瘤细胞的增殖,主要作用机制是:miR-199a*作用于靶基因c-Met,影响其下游信号通路蛋白p-ERK、p-Akt以及细胞周期相关蛋白p-Rb等的表达;同时,miR-199a*可以影响凋亡相关信号蛋白caspase-3等的表达,诱发葡萄膜黑色素瘤细胞的凋亡。