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乳腺癌是女性癌症患者中患病比例最高的异质性恶性肿瘤,目前乳腺癌治疗中面临的主要困难是乳腺癌转移以及肿瘤耐药性,因此研究新型抗肿瘤转移敏感性药物将具有重要的临床意义。开发已上市药物的抗癌转移功能及其分子机制是最为快速有效的方式。环孢素A(Cyclosporine A,CsA)是一种临床中常用的免疫抑制剂,常用于器官移植后的抗排斥治疗。近年来的研究发现,环孢素A具有抑制乳腺癌细胞增殖和转移的功能,但也有统计分析结果显示使用环孢素A人群中乳腺癌发病率低于普通人群,因此进一步研究环孢素A在乳腺癌转移中的作用及机制有助于拓展环孢素A的应用。环孢素A通过与细胞内的肽酰脯氨酰异构酶蛋白家族,即亲环素蛋白家族(Peptidylprolyl isomerase,或cyclophilin)发挥免疫抑制功能。近期的组学分析发现,亲环素蛋白家族成员亲环素类似蛋白2(Peptidylprolyl isomerase(cyclophilin)-like 2,PPIL2,即Cyp60、CYP4)调节肌动蛋白细丝F-actin的分布,并且是肿瘤转移相关小RNAmiR-31的下游靶基因,说明PPIL2可能与癌症转移有关。本文旨在研究PPIL2在乳腺癌转移中的功能及可能性,以理解和探索环孢素A应用于乳腺癌治疗的可能性。本文主要研究内容如下:(1)以人类乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和ZR-75-30以及人类乳腺细胞MCF-10A为实验材料,通过相差显微镜成像、免疫印迹和免疫荧光实验发现,PPIL2表达水平与乳腺癌细胞的形态和F-actin分布存在相关性;通过细胞划痕、Transwell侵袭小室、免疫印迹、免疫荧光和小鼠乳腺癌肺转移模型实验表明,PPIL2抑制乳腺癌细胞侵袭与转移。(2)通过免疫印迹、RT-PCR和报告基因实验发现PPIL2调节上皮细胞-间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程相关的分子标志物蛋白的表达水平,并通过下调EMT调节因子SNAI1蛋白水平,减少其在E-cadherin启动子上的结合,从而确定PPIL2负调控EMT过程。(3)以人类乳腺癌细胞系MCF-7和ZR-75-30为实验材料,利用免疫共沉淀、哺乳动物双杂交证明细胞内PPIL2结合SNAI1,利用GST-pulldown实验表明PPIL2和SNAI1存在直接相互作用;通过构建PPIL2和SNAI1截短体表达质粒进行免疫共沉淀发现PPIL2的U-box结构域介导其与SNAI1的结合,SNAI1的氮末端介导其与PPIL2的结合。通过免疫荧光实验发现,PPIL2和SNAII共定位在乳腺癌细胞核内。(4)以人类乳腺癌细胞系MCF-7和ZR-75-30为实验材料,通过免疫印迹、免疫共沉淀和核质分离实验发现PPIL2通过促进细胞核内SNAI1的K48类型泛素化,降低其蛋白稳定性,减少细胞内SNAI1蛋白水平。(5)以人类乳腺癌细胞系ZR-75-30为实验材料,通过免疫印迹、免疫共沉淀、免疫荧光、细胞划痕、Transwell侵袭小室和小鼠乳腺癌肺转移模型实验发现环孢素A通过PPIL2抑制乳腺癌细胞的侵袭与转移。(6)以人乳腺癌组织样本为实验材料,通过免疫组织化学方法分析PPIL2与SNAI1在乳腺癌组织中的表达及意义,发现PPIL2与SNAI1在乳腺癌组织中的表达呈显著负相关性,并且PPIL2和SNAI1表达水平与乳腺癌组织的浸润和转移状态具有显著相关性。综上所述,本论文揭示了 PPIL2通过影响F-actin分布和促进SNAI1泛素化降解调控EMT及乳腺癌转移的分子机制,并且环孢素A抑制乳腺癌转移依赖PPIL2进行。该结果有助于进一步理解环孢素A和亲环素蛋白在乳腺癌中的功能,”为将环孢素A开发为新型抗癌药物提供新的思考方向。