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小RNA(MicroRNA,miRNA)在转录后基因沉默过程中扮演重要角色,它可以介导具有同源序列的靶基因miRNA裂解或抑制其翻译。野生大豆(Glycine soja)是栽培大豆改良的重要遗传资源,对其开展miRNA的鉴定与功能研究,将进一步促进野生大豆资源在栽培大豆育种中的利用。本研究利用小分子RNA文库串联测序、Solexa高通量测序等技术,对抗旱野生大豆资源S101中的小分子RNA进行分离、鉴定,从中获得与抗旱相关的miRNA;结合靶基因裂解位点验证实验,通过构建miRNA表达载体、转化拟南芥,对miRNA的功能进行初步研究。本研究在野生大豆miRNA的分离、鉴定与功能分析等方面获得了大量重要信息,进一步拓宽了对植物miRNA的理解和认识。详细研究结果如下:1、小分子RNA文库串联测序数据分析通过构建小分子RNA文库并串联测序,共获得2,880条小分子RNA序列,序列分布图显示19~24 nt的序列为1,347条(1,022条单一序列),占46.8%;21nt小分子RNA表达丰度最高,占334条(223条单一序列)。①与已知miRNA(miRBase_mature, Release 11.0)同源比对发现,有15条小RNA序列与植物已知miRNA一致或同源(≤2bp mismatches),其中14条序列与栽培大豆miRNA同源。它们分别隶属于8个保守家族:miR156、miR159、miR160、miR167、miR168、miR171、miR319和miR396。除了miR171家族以外,其他7个保守家族均已在大豆中报道;②与栽培大豆EST数据库分析发现, 15个保守miRNA候选者中有9个可以在27条大豆EST序列中找到完全匹配的位点,其中gso-miR167对应的两条前体序列与大豆已知miR167前体序列不同,但能形成特征性的发卡环结构,说明miR167可能有两个新的候选者及其前体;③在预测分析新miRNA的过程中发现,442条候选小RNA序列中有74条可以在407条大豆EST序列中找到完全匹配的位点,其中9条小RNA序列(8个家族)对应的22条EST序列具备miRNA前体特征;④预测发现的15个保守miRNA和9个新miRNA候选者的长度均在20-22nt之间,多数5’端为尿嘧啶,符合miRNA的典型特征。2、小分子RNA文库高通量测序数据分析新一代测序技术为miRNA的分离、鉴定提供了高效的分析平台。利用Solexa高通量序列测定仪,分析了野生大豆小分子RNA文库,共获得高质量序列3,161,992条(1,282,308条单一序列)。①与大豆基因组序列信息分析表明,12,734条小RNA对应的基因组序列能通过mFold和mirCheck检测,具备miRNA的特征性的发卡环结构,由此可见miRNA群体的复杂程度。经过进一步的复杂分析和严格筛选,共得到141个保守的miRNA和171个新miRNA;②171个新miRNA中,53个新miRNA共预测到206个靶基因,其功能涉及到植物生长发育和环境响应的各个方面;③分析结果还发现许多值得深入研究的现象。例如:在植物中普遍存在的miR159和miR319前体中发现了串联miRNA的现象、某些保守miRNA星号链的大量存在、大豆miRNA前体的正负链匹配等。3、miRNA功能的初步分析对小分子RNA文库串联测序获得的8个保守和8个新的miRNA家族进行了Nothern杂交、靶基因预测、转化拟南芥等初步的功能分析。①Nothern杂交验证表明,8个保守和8个新的miRNA家族在野生大豆正常生长和干旱胁迫情况下都有表达,但表达丰度各异。其中,4个保守miRNA和3个新miRNA在干旱胁迫前后表现为不同程度的丰度变化。miR160、miR167、miR319、miR396和gso-miR2在干旱胁迫后明显下调表达;gso-miR1和gso-miR6干旱胁迫后上调表达。针对8个新发现的miRNA家族的组织特异性分析表明,所有miRNA在正常生长的野生大豆的根、茎、叶中的表达丰度均各有特点。多数表现为高度的组织特异性表达,并且倾向于在根中相对高丰度表达。②靶基因预测分析发现,7个新的miRNA家族对应的32个靶基因多数为功能上已注释的抗病或抗性蛋白。靶基因裂解位点验证实验表明,其中gso-miR7对应的功能未知基因TC233731和gso-miR8对应的TC225607(R 9蛋白)的裂解位点与预测一致。③通过构建miRNA表达载体、转化拟南芥,对gso-miR5、gso-miR6、gso-miR7和gso-miR8进行了miRNA功能的初步研究,发现gso-miR8对应的T1代植株表现出早开花的突变表型。