血管生长因子（Angiogenin，Ang）是一个小的单聚蛋白，与RNase A是同系物，在组织和细胞中分布广泛。Ang的RNase活性很低，但它裂解RNA的活性对于它的血管生成活性非常重要。研究表明，Ang的血管生成活性与该蛋白表面的两个活性位点有关：一个裂解RNA，另一个与细胞受体结合。血管生长失控与许多病理条件有关。这在肿瘤生长过程中表现尤为明显。肿瘤的生长和转移依靠血管的生成。血管与间质占实体肿瘤干重的50％。除了为肿瘤提供营养，血管还为肿瘤细胞进入循环系统并转移提供了通道。因此，抑制血管的生长既可以阻止肿瘤的生长，也可以防止其转移。此外，Ang还参与关节炎、硬皮症和糖尿病引起的视网膜病变等病理过程。 核糖核酸酶抑制因子（ribonuclease inhibitor,RI）能够以1：1的比例结合并抑制Ang，这无疑为我们提供了一条重要的纠正Ang引起的新生血管生长失控的途径，从而治疗相关疾病。RI是哺乳动物细胞浆中的一种酸性蛋白质，分子量50kD。实验证实，将RI注射到小鼠的移植肿瘤组织内，导致实体肿瘤组织大面积坏死及新生血管明显减少。根据RI一级结构的一个重要特点，32个半胱氨酸残基全部为还原状态，我们认为RI具有抗氧化的作用。这一作用在细胞水平得到证实：能够过表达RI的C₆细胞抗过氧化氢损伤的能力明显增强。因此，通过基因工程的方法生产具有生物活性的RI无疑具有重要作用。 对于RI的研究，我们实验室作了大量的工作。于秀平博士已经构建了RI的克隆载体pT7-ri，测序表明与已知人胎盘RI基因的cDNA序列完全相同。本文的工作是在此基础之上完成的。首先设计一对特异性引物，以pT7-ri为模板，PCR反应扩增出ri基因，并在其上下游分别引入BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ酶切位点。T4 DNA连接酶连接PCR产物与载体pGEX-2T，构建融合表达载体pGEX-2T-ri。转化感受态大肠杆菌DH5 α，经PCR及限制性内切酶分析得到阳性克隆。0.5 mmol/L IPTG诱导表达4小时，表达量最佳，约占菌体总蛋白的15％～20％。SDS-PAGE证明，重组融合蛋白的分子量约76kD，并主要以包涵体的形式存在。其次对包涵体体外复性进行研究。用离子型与非离子型去污剂反复洗涤包涵体，尽可能去除膜蛋白。将较为纯净的包涵体溶解于8 mo比的尿素溶液中，4℃放置过夜。将变性液的蛋白质浓度调至0.巧m创mL，并置于2.5m。比尿素一100^。vLp一琉基乙醇中4℃透析24小时。然后置于20 mmol几介s一el（pH7.5）中透析24小时，彻底除去变性剂。最后得到的产物具有较高的抑制RNaseA的活性（1 50U/L）。复性的GST一班经KNase A-Sepharose4B亲合层析纯化，sDs一PAGE鉴定得到单一的GST一RJ条带。纯化的融合蛋白于24℃经凝血酶作用16小时，可被切割成50kD的班和26kD的GST。W七stem一blot证实粗包涵体、复性的GST一RJ以及凝血酶切割后得到的50kD的犯均能够与兔抗人IU抗体结合。 载体pGEX一ZT是含有可诱导的强tac启动子、lacl阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的谷肤甘肤S转移酶（GST）融合蛋白表达载体。由于lac户基因的存在，使载体即使在大肠杆菌lad菌株中亦可诱导表达，对宿主没有选择性。利用此载体，本文成功的构建了融合表达质粒pGEx一ZT一ri，得到租的大量表达，并对包涵体蛋白质的复性作了初步的探讨。得到GST一班的最佳复性条件:2.5m。比尿素一loomm。比p一琉基乙醇，蛋白质浓度。.巧m创mL。这些工作为IU的基因工程生产奠定了理论基础。