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[目的]
JWA基因是周建伟等1998年发现和克隆的受全反式维甲酸诱导的新的细胞骨架相关基因。近年来研究显示该基因具有肿瘤转移抑制作用。目前关于JWA基因与人类食管癌发生、发展关系的研究国内外尚未见报道。本文旨在探讨JWA基因对食管鳞癌Eca109细胞增殖及侵袭能力的影响。通过基因重组技术构建JWA真核表达载体,将其转染人食管癌Eca109细胞株,观察重组表达载体对Eca109细胞生物学行为的影响。探寻JWA基因在食管癌Eca109细胞发生、发展中的作用,从而为食管癌机理研究和基因治疗方面提供新的思路和理论依据。
[方法]
1)提取Eca109细胞总RNA,根据人JWA基因序列设计引物,应用RT-PCR法扩增目的片断,通过双酶切定向克隆的方法构建JWA真核表达载体pcDNA3.0-JWA。
2)应用脂质体(Lipofectamine2000)将重组表达载体导入Eca109细胞,G418筛选阳性克隆,PCR鉴定转染结果。
3)通过MTT比色、软琼脂集落形成、Transwell细胞运动和Transwell细胞侵袭等一系列细胞功能学实验,观察稳定转染细胞株JWA表达对肿瘤细胞增殖、粘附、运动和侵袭的影响。
[结果]
1)经过筛选、酶切以及测序鉴定,证实成功构建JWA基因真核表达载体pcDNA3.0-JWA。
2)经脂质体转染及G418筛选,重组体组及空载体组均有阳性克隆形成,用PCR法证实两种载体均成功整合到受体细胞基因组DNA中。重组体转染组细胞中JWA基因mRNA和蛋白表达量较空载体转染组和未转染组上调。
3)对转染前后的肿瘤细胞观察表明,重组体转染组细胞生长减慢,克隆形成率降低,细胞迁移、运动能力和侵袭能力降低。
[结论]
1)成功构建了JWA基因的真核表达载体。
2)应用脂质体转染法成功将JWA基因的真核表达载体导入Eca109细胞,真核表达载体显著上调了JWA基因mRNA和蛋白的表达。
3)JWA基因真核表达载体能够显著抑制食管癌Eca109细胞增殖,降低肿瘤细胞对周围组织的侵袭作用,提示JWA基因可能是食管鳞癌生物治疗的潜在靶点。