卵巢癌是妇科恶性肿瘤中最致命的一种，其中 90%为上皮性卵巢癌。因起病隐匿，大部分患者发现时处于晚期。治疗的策略主要以手术治疗为主，紫杉醇与铂类为基础的化疗为辅。近20年来，尽管卵巢癌的手术和化疗都有了很大的发展，但因为传统化疗药物患者的耐药性逐渐增加，总的生存率仍然维持在较低的水平，迫切需要新的更有效的治疗方法。　　EGFR 家族（包括Her1 (EGFR, ErbB1)、Her2 (Neu, ErbB2)、Her3 (ErbB3) 和Her4 (ErbB4)）是重要的酪氨酸受体激酶。EGFR通过介导细胞外信号对细胞增殖、凋亡和迁移进行调控。异常的EGFR信号通路参与许多肿瘤的发展，并被发现通过刺激Akt及Erk通路在化疗耐药方面起重大作用。在卵巢癌中，大多数研究发现EGFR高表达，并与预后不良相关。目前，EGFR抑制剂已被认为是一种在卵巢癌中很有前途的靶向治疗药物，许多药物研发工作者致力于研发有效的EGFR抑制剂。然而，第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）如厄洛替尼和吉非替尼被报道治疗卵巢癌效率很低，反应率分别仅为6%和4%，这表明需要更有效的表皮生长因子受体抑制剂。第二代EGFR酪氨酸激酶抑制剂，如Dacomitinib，是不可逆的EGFR抑制剂，比第一代更有效，Dacomitinib在卵巢癌中的研究鲜有报道。　　本研究拟通过组织学实验及病例随访分析，研究EGFR在卵巢癌组织中的表达，探讨其与卵巢癌发生发展、预后及化疗敏感性的关系。在卵巢癌 SKOV3、OV4 及SKOV3-DDP细胞系中，应用MTT assay 、Caspase assay、流式细胞仪、Western blot及细胞转染、网络数据挖掘等手段，研究EGFR抑制剂Dacomitinib对卵巢癌细胞生长、凋亡、迁移及顺铂敏感性的影响及其机制。　　第一部分 EGFR在上皮性卵巢癌组织中的表达及其与预后、化疗敏感性的关系　　研究目的　　组织水平上通过检测EGFR在卵巢癌组织中的表达，探讨其与卵巢癌发生发展、预后及化疗敏感性的关系。　　研究方法　　1.免疫组化法检测 EGFR 在卵巢癌组织中的表达，探讨其在卵巢癌中表达的临床意义。组织样本来源为青岛市妇女儿童医院和淄博市妇幼保健院 2009 年 1 月--2012年1月存档组织石蜡标本，其中原发卵巢癌67例、正常卵巢组织20例。　　2.person’sχ2 test分析研究EGFR表达与上皮性卵巢癌不同病理特征之间的关系、EGFR表达与化疗疗效的关系，同时采用Kaplan Meier生存分析、Cox比例风险模型分析EGFR的表达与卵巢癌总生存期之间的关系。　　结果　　1．67例上皮性卵巢癌患者中的EGFR高表达率为52.24%（35/67），显著高于正常卵巢组织5%（1/20），差异有统计学意义（P<0.05）。　　2．EGFR表达与临床晚期、未行满意的肿瘤细胞减灭术有关（P<0.01），EGFR表达率与年龄（P>0.05）、是否转移（P>0.05）无关。　　3．EGFR高表达患者的化疗敏感率45.71%（16/35），显著低于EGFR低表达组81.25%（26/32），两者间差异显著（P<0.01）。　　4．EGFR低表达患者存活时间长于EGFR高表达者（P=0.043），Kaplan Meier的生存分析显示以下因素与患者总体生存有关：FIGO分期，腹水，满意的肿瘤细胞减灭术和EGFR的表达。使用Cox比例风险模型进行单因素分析显示，FIGO分期、腹水、满意的CRS和EGFR的表达是生存的重要因素。当上述参数都包含在一个多变量分析中结果表明，FIGO分期、满意的CRS和EGFR表达是影响生存的独立因素。　　小结　　1．相较于正常卵巢组织，EGFR在上皮性卵巢癌组织中高表达，　　2．上皮性卵巢癌中EGFR的表达水平与肿瘤的临床分期及是否完成满意的肿瘤细胞减灭术相关。　　3．EGFR表达水平与上皮性卵巢癌患者预后明显相关。　　4．EGFR表达水平与卵巢癌化疗敏感性相关。　　第二部分 EGFR抑制剂Dacomitinib对上皮性卵巢癌细胞生物学行为的影响　　研究目的　　EGFR抑制剂Dacomitinib对卵巢癌细胞增殖、凋亡、自噬、细胞周期的影响及可能的分子机制。　　研究方法　　1．用不同浓度Dacomitinib处理细胞（0μm/l，0.01μm/l，0.1μm/l，1μm/l, 10μm/l和25μm/l），MTT法检测其对SKOV3和OV4细胞增殖的影响。　　2．采用不同浓度的Dacomitinib（0μm/l、0.3μm/l、1μm/l和3μm/l）处理细胞，流式细胞术、Caspase assay、western blot检测其对卵巢癌SKOV3和OV4细胞凋亡、自噬能力及细胞周期的影响。　　3．采用不同浓度的Dacomitinib（0μm/l、0.3μm/l、1μm/l和3μm/l）处理细胞， western blot检测其对卵巢癌细胞中EGFR、HER2及下游通路AKT、ERK蛋白表达的影响。在SKOV3细胞系中，分别用MK2206及AKT siRNA与Dacomitinib1μm/l联合处理细胞，通过流式细胞术检测细胞凋亡及western blot检测其凋亡蛋白，寻找影响细胞生物学行为的可能机制。　　结果　　1.Dacomitinib抑制卵巢癌SKOV3和OV4细胞的增殖。Dacomitinib处理后24小时、48小时细胞存活率明显降低，处理24小时后的IC50 在SKOV3细胞为6.416， OV4细胞为4.845。处理48 小时后的IC50 在SKOV3细胞为1.880，OV4细胞为0.546。　　2.Dacomitinib有促进卵巢癌SKOV3和OV4细胞凋亡的作用，并呈现剂量依赖性。流式细胞仪分析，在SKOV3细胞，0、0.3、1、3μmol/l药物处理组的细胞凋亡率分别为3.7%、22.37%、24.77%、34.27%，在OV4细胞，药物处理组的细胞凋亡率分别为1.77%、7.5%、13.43%、23.87%，差异有统计学意义（P<0.01）。Caspase-Glo 3/7 Assay 提示， 0.3、1和3μmol/l Dacomitinib处理后，SKOV3细胞内Caspase3/7蛋白酶活性明显升高，荧光值从对照组 0.563±0.032逐渐升高为 1.846±0.021，同样在OV4细胞中从荧光值对照组0.637±0.027逐渐升高为1.766±0.028。差异有统计学意义（P<0.05）。Western-blot表明随着Dacomitinib浓度的升高，促凋亡蛋白caspase 9、Bax表达逐渐升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表达逐渐下降。　　3.Dacomitinib有促进卵巢癌SKOV3和OV4细胞自噬的作用，并呈现剂量依赖性。流式细胞仪分析，在SKOV3细胞，0、0.3、1、3μmol/lDacomitinib处理组的细胞自噬率分别为9.5%、17.67%、19.37%、41%，在OV4细胞，不同浓度药物处理组的细胞自噬率分别为8.93%、20.03%、34%、46.47%，差异有统计学意义（P<0.05）。Western-blot表明随着Dacomitinib浓度的升高，自噬相关蛋白LC-3表达逐渐增加。　　4．Dacomitinib阻滞卵巢癌SKOV3和OV4细胞周期于G1期。流式细胞术提示，随着Dacomitinib浓度的逐渐增加，G1期细胞比例从对照组的48.82%显著提升至3μmol/l组的63.62％左右，同时Dacomitinib对S期细胞比例有明显的降低作用。在OV4细胞系，G1期细胞比例从40.51%提升至65.55％，S期细胞比例有明显的降低。差异有统计学意义（P<0.05）。.Western-blot表明随着Dacomitinib浓度的升高，细胞周期相关蛋白CDK1、CDK2表达逐渐降低。　　5．在SKOV3和OV4细胞，分别用0、0.3、1、3μmol/l Dacomitinib处理后， p-EGFR、p-HER2、p-AKT、p-Erk1/2 表达均大大降低，但t-EGFR、t-AKT、t-Erk1/2表达不变。AKT抑制剂MK2206与Dacomitinib联用，与单用Dacomitinib组相比，细胞凋亡率明显增加， AKT蛋白的磷酸化被明显抑制，凋亡相关Bax蛋白表达增加。AKT SiRNA显示同样的结果。　　小结　　1．Dacomitinib对上皮性卵巢癌SKOV3及OV4细胞的增殖能力有抑制作用，呈时间和剂量依赖性。　　2. Dacomitinib对上皮性卵巢癌SKOV3及OV4细胞有促进凋亡的作用，该作用与Caspase家族及Bcl-2家族的活化有关，呈剂量依赖性。　　3. Dacomitinib对上皮性卵巢癌SKOV3及OV4细胞有促进自噬的作用，该作用与分子水平上调节LC3蛋白有关，呈剂量依赖性。　　4．Dacomitinib阻滞上皮性卵巢癌SKOV3及OV4的细胞周期于G1期，该作用通过调节细胞周期蛋白相关激酶（CDKs）实现，呈剂量依赖性。　　5．Dacomitinib可能通过影响AKT及ERK途径发挥抑瘤作用。　　第三部分 Dacomitinib对上皮性卵巢癌细胞迁移及顺铂敏感性的影响　　研究目的　　1.探讨EGFR抑制剂Dacomitinib对卵巢癌细胞迁移侵袭的影响。　　2.探讨EGFR抑制剂Dacomitinib联合顺铂对上皮性卵巢癌耐药细胞的作用，并初步探讨其增加顺铂敏感性的可能机制。　　研究方法　　1.划痕实验及western-blot检测Dacomitinib对SKOV3及OV4细胞迁移侵袭及EMT的影响。　　2.MTT法检测Dacomitinib作用前后顺铂对SKOV3-DDP细胞生长的影响。　　3.流式细胞术检测 Dacomitinib 联合顺铂对卵巢癌 SKOV3-DDP 细胞凋亡的影响。　　4. Western blot检测p-EGFR、P-gp在SKOV3及SKOV3-DDP细胞系中的表达，并检测 control 组、顺铂组、Dacomitinib 组、Dacomitinib 联合顺铂组对卵巢癌SKOV3-DDP细胞p-EGFR、P-gp表达的影响。　　结果　　1.Dacomitinib 抑制卵巢癌 SKOV3 和 OV4 细胞迁移侵袭及 EMT，不同浓度的Dacomitinib处理SKOV3细胞和OV4细胞后，划痕的愈合能力在处理组明显低于对照组，细胞迁移受到抑制，差异具有统计学意义（P<0.05）。western blot表明不同浓度的Dacomitinib处理后，EMT相关蛋白E-cadherin的表达增加，slug的表达降低。两者变化均呈剂量依赖关系。　　2.MTT法检测顺铂对SKOV3、SKOV3-DDP细胞增殖的影响，结果显示顺铂在SKOV3细胞24小时IC50=12.27μmol/l，在SKOV3-DDP细胞24小时IC50=64.34uM，耐药指数为5.24。1μmol/lDacomitinib与DDP 联合作用SKOV3-DDP细胞24小时， 发现联合用药组顺铂的IC50为11.3，逆转耐药倍数为5.69。说明Dacomitinib可以增加顺铂对SKOV3-DDP细胞的抗增殖作用。　　2. 流式细胞术检测Dacomitinib联合顺铂对卵巢癌SKOV3-DDP细胞凋亡的影响。提示在SKOV3/DDP细胞中，顺铂组、Dacomitinib组、Dacomitinib+顺铂组的凋亡率分别为15.3%、24.7%、35.9%，显著高于control组的凋亡率3.6%，且联合药物组的凋亡率显著高于单一用药组（P<0.05）。　　3. western blot实验提示，与SKOV3细胞相比，SKOV3-DDP细胞中p-EGFR、p-gp蛋白表达明显增加。在SKOV3-DDP细胞中，与未用药物处理组相比，顺铂、Dacomitinib，顺铂+Dacomitinib处理组，p-EGFR、P-gp蛋白表达量显著减少，顺铂+Dacomitinib处理组两种蛋白表达量显著低于单用顺铂组（P<0.05）。　　小结：　　1.Dacomitinib通过调节E-cadherin和slug蛋白的表达抑制卵巢癌SKOV3及OV4细胞的迁移侵袭，抑制作用呈剂量依赖性。　　2.Dacomitinib与顺铂联用，在抑制细胞增殖及细胞凋亡上表现出协同作用。　　3.Dacomitinib增加卵巢癌细胞的化疗敏感性，机制可能主要通过抑制p-gp蛋白的表达来实现，EGFR通路的抑制可能参与了该过程。　　结论　　1.EGFR在上皮性卵巢癌中表达水平明显高于正常卵巢组织。其表达水平与肿瘤的临床分期及是否能完成满意的肿瘤细胞减灭术相关，与上皮性卵巢癌的预后及化疗敏感性相关。　　2.Dacomitinib 可通过抑制卵巢癌细胞 p- EGFR 的表达调控下游通路 p-Akt、p-Erk1/2 蛋白表达降低，进而影响卵巢癌胞凋亡、自噬及侵袭迁移。　　3.Dacomitinib能通过抑制p- EGFR、P-gp蛋白表达增加耐药卵巢癌细胞的顺铂敏感性。　　4.Dacomitinib有希望成为卵巢癌新的靶向治疗药物，为卵巢癌辅助治疗带来新前景。