【摘 要】
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表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（Epidermal growth factor recetor variant Ⅲ,EGFRvⅢ）是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,EGFRvⅢ在胶质母细胞瘤的细胞表面大量表达,细胞内信号通路被不断激活,进而激发肿瘤细胞的异常增殖。且EGFRv Ⅲ在正常组织中不表达,因此以EGFRv Ⅲ胞内区作为干预治疗胶质母细胞瘤的理想靶点。本试验使用EGFRvⅢ胞内区重组腺病毒对一
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表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（Epidermal growth factor recetor variant Ⅲ,EGFRvⅢ）是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白,EGFRvⅢ在胶质母细胞瘤的细胞表面大量表达,细胞内信号通路被不断激活,进而激发肿瘤细胞的异常增殖。且EGFRv Ⅲ在正常组织中不表达,因此以EGFRv Ⅲ胞内区作为干预治疗胶质母细胞瘤的理想靶点。本试验使用EGFRvⅢ胞内区重组腺病毒对一周岁健康双峰驼进行免疫,采集外周血淋巴细胞提取总RNA,然后反转录出cDNA来,经过PCR扩增出所需单域抗体基因,把其同载体p MECS连接,以构建重组噬菌体抗体展示文库。使用商品化的人EGFRv Ⅲ蛋白通过噬菌体展示技术筛选,再对筛选结果用Phage ELISA鉴定,能够得到拥有与人EGFRv Ⅲ胞内区蛋白结合力高的阳性克隆。用p ET-22b载体与筛出的阳性克隆基因连接起来,经过低温诱导以及可溶性表达,能够取得抗EGFRv Ⅲ胞内区蛋白特异性单域抗体,亲和活性通过ELISA来检测。试验结果如下:（1）使用EGFRvⅢ胞内区重组病毒免疫骆驼后,得出血清抗体效价达1:800,接着建立了库容为9.7×10~8,重组率为95.8%的EGFRvⅢ胞内区噬菌体抗体库,对其筛选获得阳性重组噬菌体5株。（2）成功得到2株不一样序列的VHH基因,并在原核表达载体上克隆出这2株单域抗体的质粒,表达和纯化出EGFRvⅢ胞内区特异性单域抗体。根据ELISA结果显示纯化后的单域抗体和EGFRv Ⅲ胞内区蛋白有较高的结合活力。鉴于EGFR胞内区基因在信号通路中的重要作用,成功筛选并制备了EGFRvⅢ胞内区蛋白特异性单域抗体,对胶质母细胞瘤的免疫治疗提供了新方向。
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