研究背景：免疫系统的毒性改变是某些外源性化学物安全性评价中较为敏感的指标,而选择敏感的生物标记物检测早期健康危害效应将会极大的提高安全性评价工作的科学性和效率。由于免疫系统组成和功能的高度复杂性,因此国际上一般采用一组试验多项指标从整体、细胞和分子水平对整个免疫系统来进行综合评价。目前,许多国家都已建立了适合于本国的免疫毒性安全性评价指南,这些指南主要被用于药品、农药、食品添加剂、生物制品及医疗器械等方面。我国免疫毒理学研究起步较晚,目前我国对外源性化合物的安全性评价中涉及免疫毒性评价的只有工业化学品毒性鉴定管理规范和中药、天然药物免疫毒性研究的技术指导原则,后者仅针对过敏性和光过敏反应。食品、农药等物质的毒理学安全性评价中均未包括免疫毒性,这不仅加大了我国在安全性评价方面的潜在风险,而且在一定程度上限制了我国在风险评估方面的发展。随着我国食品工业技术的发展,不乏有一些外源性物质可能是以免疫系统作为靶器官,因此建立快速、灵敏的免疫毒理学安全评价的检测方法迫在眉睫。近年来,全球农药工业发展十分迅速,绝大多数国家均已实施了农药登记管理制度,对农药的安全性资料提出了明确的要求,美国等国家已规定在农药登记时需提供免疫毒性方面的资料。目前,我国尚未建立免疫毒性评价指南,故新农药的登记管理上无法提出免疫毒性资料的要求。2013年9月JMPR将召开专家会议对一些农药进行重新评估,其中免疫毒性等特殊毒性资料也是作为重点考虑的内容之一。此外,全球转基因作物发展迅猛,与此同时有一些研究表明转基因作物及外源基因表达的蛋白质可能会对实验动物及人的免疫系统造成一定影响。因此,有必要对农药和转基因作物的免疫毒性进行评价。目的：初步建立啮齿类动物一级和二级体内/体外免疫毒性筛选体系,为我国免疫毒性评价方法的建立提供参考依据。应用所建立的免疫毒性评价体系研究马拉硫磷和莠去津两种农药和转Bt CrylAh基因抗虫玉米的免疫毒性,初步探索其产生免疫毒性的靶点和可能的毒性机制。为马拉硫磷和莠去津这两种农药的登记管理和食品中农药最大残留量的制订,以及为转Bt CrylAh基因抗虫玉米的食用安全性评价和商业化生产提供科学依据。本课题包括三部分：第一部分：环磷酰胺诱发BALB/c小鼠免疫毒性模型的一级和二级体内/体外免疫毒性筛选体系研究方法：选用雌性BALB/c小鼠,体重18 g-22 g。动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养。试验周期为30天。研究建立一级筛选和二级筛选体系,共设9个免疫组,免疫组1-4用于一级筛选试验,免疫组5-9用于二级筛选试验。每个免疫组设5个试验组,即1个对照组(每日经灌胃给予蒸馏水)和4个环磷酰胺组(分别为环磷酰胺灌胃组,每日经灌胃给予40 mg/kg BW环磷酰胺；环磷酰胺腹腔注射1组,每日经腹腔注射给予40mg/kg BW环磷酰胺；环磷酰胺腹腔注射2组,试验开始先连续腹腔注射3天环磷酰胺,后每周注射一次,注射剂量为80mg/kg BW;环磷酰胺腹腔注射3组,试验结束前24h一次性腹腔注射200mg/kg BW环磷酰胺)。小鼠喂饲普通饲料,自由摄食和饮水。一级筛选：免疫病理学指标包括：小鼠体重及脏器系数(肝脏、肾脏、脾脏、胸腺和淋巴结)；血液学指标；血生化指标；肝脏、肾脏和免疫器官脾脏、胸腺、淋巴结(颈部淋巴结、腋下淋巴结、耳部淋巴结、肠系膜淋巴结、Peyer氏淋巴结)、骨髓的组织病理学观察。体液免疫包括：T细胞依赖性抗体反应(测定脾空斑形成细胞数)和血浆免疫球蛋白水平(酶联免疫吸附法法测定血浆IgA、IgM和IgG水平)。细胞免疫包括：ConA诱导的脾T琳巴细胞增殖试验和LPS诱导的脾B淋巴细胞增殖试验。非特异性免疫测定NK细胞活性。二级筛选：免疫病理学指标包括：外周血淋巴细胞表型分析(采用流式细胞术分析外周血T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、Th细胞、Ts细胞比例以及CD4/CD8比值)、骨髓细胞分类及其百分比、脾细胞数、免疫器官精密测定(脾脏测定脾动脉周围淋巴鞘和生发中心,Peryer氏淋巴结测定淋巴滤泡和生发中心)。体液免疫方面采用流式细胞术对血清细胞因子IL-2、IL-4、IL-5、IL-10、γ-IFNTNF进行测定以及血清溶血素的测定。细胞免疫包括：迟发型变态反应(小鼠足跖增厚法)和细胞毒性T细胞杀伤能力测定。非特异性免疫对巨噬细胞功能进行测定(小鼠碳廓清试验)结果：一级筛选试验：免疫病理学：体重和脏器系数：环磷酰胺灌胃组、注射1组和注射2组动物周体重和Peyer氏淋巴结数均较对照组显著降低(P<0.05),而环磷酰胺注射3组与对照组无显著性差异(P>0.05)。环磷酰胺灌胃组和注射1组Peyer氏淋巴结数显著低于注射2组和注射3组(P<0.05)。环磷酰胺灌胃组和注射1组肝脏相对重量显著高于对照组,且肾脏重量也发生显著变化(P<0.05)。四个不同环磷酰胺给予组的脾脏绝对重量和胸腺绝对/相对重量均显著低于对照组(P<0.05),其中环磷酰胺灌胃组和注射1组对胸腺绝对/相对重量的影响程度较另外两个环磷酰胺组显著(P<0.05),而注射2组和注射3组对脾脏相对重量的影响更为明显(P<0.05)。仅环磷酰胺注射3组淋巴结绝对重量显著低于对照组(P<0.05),其他环磷酰胺组未见对淋巴结的重量有明显影响(P>0.05)血液学：四个环磷酰胺给予组动物的白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。环磷酰胺灌胃组、注射1组和注射2组的嗜碱性粒细胞百分比、MCHC和RDW与对照组比较有显著性差异(P<0.05)。环磷酰胺注射1组PLT水平显著高于对照组(P<0.05)。血生化：环磷酰胺灌胃组、注射1组和注射2组动物血清总蛋白和白蛋白水平较对照组显著降低(P<0.05)。环磷酰胺灌胃组和注射1组血清甘油三酯显著低于对照组、注射2组和注射3组(P<0.05)。环磷酰胺注射1组动物血清谷丙转氨酶和血糖水平与对照组和环磷酰胺其他组比较也有显著性差异(P<0.05)。组织病理学：四个环磷酰胺不同给予组动物均出现胸腺萎缩、脾脏白髓萎缩、骨髓造血细胞减少、淋巴结(颈部、腋下、耳部、肠系膜淋巴结及Peyer氏淋巴结)萎缩等病变,且环磷酰胺灌胃组和注射1组动物出现肝脏病变。环磷酰胺灌胃组和注射1组动物胸腺和脾脏萎缩严重程度显著高于注射2组和注射3组,而环磷酰胺不同给予方式均可造成Peyer氏淋巴结明显萎缩。体液免疫：抗体形成细胞数检测结果显示,环磷酰胺不同给予组小鼠空斑形成细胞较对照组显著下降(P<0.05),尤以环磷酰胺灌胃组和注射1组的下降最为明显(P<0.05)。环磷酰胺不同给予组小鼠血浆免疫球蛋白IgA、IgG水平较对照组显著下降(P<0.05),环磷酰胺灌胃组、注射1组和注射2组的血浆IgM也显著下降(P<0.05)细胞免疫：环磷酰胺不同给予组小鼠脾T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖能力均显著低于对照组(P<0.05)。非特异性免疫：仅环磷酰胺注射2组小鼠NK细胞活性低于与对照组(P<0.05)。二级筛选试验：免疫病理学：外周血淋巴细胞表型分析：环磷酰胺注射2组和注射3组外周血T淋巴细胞百分比、Th细胞百分比、C D4+/CD8+比值显著高于对照组、环磷酰胺灌胃组和注射1组(P<0.05)；灌胃组、注射1组和注射2组Ts细胞百分比显著高于对照组(P<0.05)。环磷酰胺灌胃组和注射1组NK细胞百分比显著高于对照组、注射2组和注射3组(P<0.05)。环磷酰胺不同给予组对小鼠外周血B淋巴细胞百分比的影响非常显著(P<0.05),尤以灌胃组明显(P<0.05)。骨髓细胞分类：在粒系中,环磷酰胺四个不同给予组的分叶粒细胞系显著高于对照组(P<0.05)；环磷酰胺灌胃组和注射1组动物早幼粒细胞较对照组和注射3组显著升高(P<0.05)。在红系中,灌胃组、注射1组和注射3组晚幼红细胞显著高于对照组(P<0.05),且注射1组早幼红细胞显著高于对照组、注射2组和注射3组(P<0.05)。环磷酰胺四个不同给予组的淋巴细胞显著低于对照组,尤以注射1组和注射2组的下降最为明显(P<0.05)。脾细胞数：环磷酰胺不同给予组小鼠的脾细胞数显著低于对照组(P<0.05),尤以注射3组最低(P<0.05)。免疫器官精密测定：环磷酰胺不同给予组小鼠脾脏的脾动脉周围淋巴鞘厚度均显著低于对照组(P<0.05)；灌胃组和注射1组脾生发中心大小显著低于对照组(P<0.05),而环磷酰胺注射2组和3组显著高于对照组(P<0.05)。环磷酰胺灌胃组和注射1组Peyer氏淋巴结淋巴滤泡和生发中心大小显著低于对照组、环磷酰胺注射2组和3组(P<0.05)。体液免疫：血清细胞因子：环磷酰胺灌胃组血清IL-5水平显著低于对照组(P<0.05)；注射2组和注射3组血清γ-IFN水平显著低于对照组、灌胃组和注射1组(P<0.05)环磷酰胺灌胃组和注射1组动物血清TNF水平显著高于对照组、环磷酰胺注射2组和注射3组(P<0.05)。血清溶血素：环磷酰胺不同给予组小鼠血清半数溶血值与对照组比较无显著性差异(P>0.05)。细胞免疫：环磷酰胺不同给予组的小鼠24h足跖厚度变化显著高于对照组(P<0.05),但环磷酰胺不同给予组之间无显著性差异(P>0.05)。环磷酰胺不同给予组小鼠细胞毒性T淋巴细胞杀伤能力无明显影响(P>0.05)。非特异性免疫：各组巨噬细胞吞噬活性之间无显著性差异(P>0.05)结论：1.环磷酰胺四种给予方法均可引起小鼠免疫器官重量、全血白细胞计数及其淋巴细胞百分比、脾细胞数、血清免疫球蛋白水平、脾空斑形成细胞数、脾淋巴细胞增殖能力的下降,外周血淋巴细胞分型中B淋巴细胞和中性粒细胞百分比以及骨髓细胞中淋巴细胞和粒系分叶的比例明显改变,小鼠迟发型变态反应也显著升高。而且组织病理学检测结果也提示四种建模方法均可引起免疫器官胸腺、脾脏、淋巴结的萎缩以及骨髓造血细胞减少。由此可见,环磷酰胺对小鼠免疫病理学、细胞免疫和体液免疫具有较为严重的抑制作用,选择其作为阳性物是适宜的。2.通过对四种建模方法进行比对,经灌胃或腹腔注射低剂量多次给予(灌胃组和注射1组)除免疫毒性非常明显外,还可引起动物体重下降、肝脏相对重量降低、血生化指标(谷丙转氨酶、血糖、甘油三酯)的改变,且病理组织学检测也提示对肝脏具有毒性作用,其免疫毒性建模方法的特异性较差。环磷酰胺一次较大剂量给予后每周强化(注射2组)和一次性大剂量给予(注射3组)这两种建模方法在免疫病理学指标、细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫的多数指标无显著性差异,但前者可引起动物体重降低、血液学指标MCHC和RDW的异常,而后者不仅能有效降低免疫功能,且操作更为简便、造模周期短、对动物损伤小、模型特异性较好。故本研究选择试验结束前24h一次大剂量腹腔给予200 mg/kg BW环磷酰胺作为免疫毒性动物模型的最适宜的方法。3.一级和二级免疫毒性筛选体系从整体、细胞和分子水平对不同免疫病理学、细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫指标进行了综合评价,结果基本是一致的,且二级筛选结果是对一级筛选的很好的补充。一级和二级相结合的免疫毒性体内／体外筛选方法能更有效地用于免疫毒性的安全性评价。第二部分：农药马拉硫磷和莠去津的免疫毒性研究方法：选用雌性BALB/c小鼠,体重18 g-22 g。动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养。试验周期为30大。首先进行一级筛选,共4个免疫组,每个免疫组设8个试验组,即阴性对照组(玉米油阴性对照),马拉硫磷低、中、高剂量组,莠去津低、中、高剂量组和阳性对照组(试验结束前24h次性腹腔注射200 mg/kg BW环磷酰胺)。马拉硫磷和莠去津高剂量的设计主要依据小鼠经口急性毒性的结果,分别为其1/4LD50和1/12LD50,组间倍比为4倍。即马拉硫磷低、中、高剂量组分别为16mg/kg BW、65mg/kg BW、258mg/kg BW;莠去津低、中、高剂量组分别为分别为23mg/kg BW、90mg/kg BW、360mg/kg BW.小鼠喂饲普通饲料,自由摄食和饮水。如一级筛选有一项检测项目为阳性,则需进行二级筛选。二级筛选设5个免疫组,每个免疫组的分组情况同一级筛选。免疫毒性一级和二级筛选免疫病理学、体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫指标和方法同第一部分。结果：马拉硫磷：一级筛选：与阴性对照组、低剂量组和中剂量比较,高剂量组肝脏相对重量和绝对重量显著升高,血清总胆固醇和谷丙转氨酶显著升高,全血白细胞数、嗜碱性粒细胞数及其百分比显著降低。组织病理学显示马拉硫磷高剂量可引起小鼠肝细胞肿胀,个别动物出现胸腺萎缩。马拉硫磷高剂量组动物血清总蛋白和白蛋白水平较阴性对照组显著降低。体液免疫毒性试验也发现,马拉硫磷高剂量组动物脾脏空斑形成细胞数显著降低,而血浆免疫球蛋白IgG水平较阴性对照组和其他剂量组显著升高(P<0.05)。马拉硫磷低剂量和中剂量胸腺相对重量和绝对重量显著升高(P<0.05)全血中性粒细胞数显著降低(P<0.05)。而马拉硫磷不同剂量组对反映细胞免疫的T淋巴细胞、B淋巴细胞增殖能力以及反映非特异性免疫的NK细胞活性无明显影响(P>0.05)。二级筛选：骨髓涂片检测结果提示,马拉硫磷三个剂量组均可引起动物骨髓细胞分类中中幼红细胞系和单核细胞显著降低。马拉硫磷高剂量组可引起外周血B淋巴细胞比例明显升高。体液免疫毒性筛选结果提示,低剂量和中剂量马拉硫磷对血清细胞因子IL-10水平以及中剂量对血清细胞因子IL-5水平的影响较为明显。细胞免疫毒性试验中马拉硫磷对细胞毒性T淋巴细胞杀伤能力、迟发型变态反应均无明显毒性作用,非特异性免疫毒性试验未见马拉硫磷对巨噬细胞吞噬能力有影响。莠去津：一级筛选：莠去津高剂量组的第1周-第3周的周体重显著低于阴性对照组,且不同剂量组之间存在明显的剂量-反应关系(P<0.05)。小鼠在低剂量莠去津的刺激下胸腺相对和绝对重量显著增加,病理组织学检查发现中和高剂量马拉硫磷可能引起BALB/c小鼠胸腺萎缩。莠去津三个剂量组动物全血白细胞数显著低于阴性对照组；高剂量组淋巴细胞和单核细胞数及百分比显著低于阴性对照组(P<0.05),且各剂量组之间存在一定的剂量-反应关系；低剂量和中剂量组中性粒细胞数较阴性对照组显著降低(P<0.05),而高剂量组中性粒细胞百分比较阴性对照组显著升高(P<0.05)。莠去津低剂量组动物血清总蛋白和白蛋白水平显著高于阴性对照组(P<0.05),而高剂量组血清总蛋白和白蛋白水平显著低于阴性对照组(P<0.05),各剂量组之间存在一定的剂量-反应关系。莠去津高剂量组肝脏和肾脏相对重量显著高于阴性对照组和其他剂量组,血清BUN和CHO显著高于阴性对照组(P<0.05)。组织病理学结果提示,莠去津中剂量和高剂量组可引起BALB/c小鼠肝细胞肿胀。体液免疫毒性试验也发现,莠去津高剂量组动物脾脏空斑形成细胞数显著降低,血浆免疫球蛋白IgG水平较阴性对照组和其他剂量组显著升高。细胞免疫毒性试验发现,莠去津高剂量组T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力较阴性对照组和其他剂量组显著降低。而莠去津不同剂量组对NK细胞活性无明显影响。二级筛选：骨髓涂片检测结果提示,莠去津三个剂量组中幼红细胞系和单核细胞比例均较阴性对照组显著降低。高剂量组脾细胞数显著降低,且存在明显的剂量-反应关系。高剂量组脾脏脾动脉周围淋巴鞘大小显著降低,且各剂量组存在明显的剂量组反应关系,脾脏生发中心的大小也显著降低。体液免疫毒性试验发现,莠去津不同剂量组血清IL-5水平较阴性对照组降低,且存在明显的剂量-反应关系。莠去津高剂量组动物的迟发型变态反应能力显著降低,且各剂量组之间存在明显的剂量-反应关系。但莠去津对对细胞毒性T淋巴细胞杀伤能力以及巨噬细胞的吞噬能力无明显影响。结论：马拉硫磷对一些免疫病理学和体液免疫指标有影响,且发现低剂量马拉硫磷即可对动物胸腺重量、骨髓细胞分类及血清细胞因子产生明显的影响,可以初步得出马拉硫磷的LOAEL为16 mg/kg BW.莠去津对一些免疫病理学、体液免疫和细胞免疫指标有影响,莠去津在低剂量时即可观察到小鼠第1周-第3周的周体重、全血白细胞数和中性粒细胞、骨髓中中幼红细胞和单核细胞比例以及血清细胞因子IL-5显著降低,可以初步得出莠去津的LOAEL为23 mg/kg BW。第三部分：转Bt CrylAh基因抗虫玉米免疫毒性研究方法：选用雌性BALB/c小鼠,体重18 g-22 g。动物经适应性饲养3天后按体重将动物随机分组,每组动物10只,按组分笼饲养。试验周期为30天。首先进行一级筛选,设4个免疫组,每个免疫组设4个试验组,即阴性对照组、亲本玉米组、转基因玉米组和阳性对照组(试验结束前24h一次性注射200 mg/kg BW环磷酰胺)。分别喂饲小鼠普通饲料、亲本玉米70%(w/w)配合饲料、转BtcrylAh基因抗虫玉米70%(w/w)配合饲料和小鼠普通饲料,动物自由摄食和饮水。如一级筛选有一项检测项目为阳性,则需进行二级筛选。二级筛选设5个免疫组,每个免疫组的分组情况同一级筛选。免疫毒性一级和二级筛选免疫病理学、体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫指标和方法同第一部分。结果：一级筛选：免疫病理学观察结果可见,转Bt crylAh基因抗虫玉米在喂饲BALB/c小鼠第4周时体重较阴性对照组显著增加,外周血单核细胞数显著下降,但与亲本玉米组比较无差异；转Bt crylAh基因抗虫玉米对BALB/c小鼠脾脏、胸腺、淋巴结、肝脏和肾脏的重量及其组织病理学、血生化指标均无影响。转Bt crylAh基因抗虫玉米对反映体液免疫的空斑形成细胞数和免疫球蛋白水平,反映细胞免疫的T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力以及反映非特异性免疫的NK细胞活性均未见影响。二级筛选：免疫病理学观察结果可见,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米可引起小鼠骨髓细胞分型中淋巴细胞和分叶状粒细胞系比例较阴性对照组显著降低,而杆状粒细胞系比例显著升高,但与亲本玉米组比较无差异；脾脏脾动脉周围淋巴鞘大小较阴性对照组显著降低,而脾生发中心大小较阴性对照组显著升高,但与亲本玉米组比较无差异。转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对反映细胞免疫的细胞毒性T淋巴细胞活性和迟发型变态反应以及反映非特异性免疫的巨噬细胞吞噬能力均未见影响,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米组动物血清细胞因子1L-5水平较阴性对照组显著下降,未见与亲本玉米组有差异。结论：通过免疫毒性一级和二级筛选评价体系,未见转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对BALB/c小鼠的免疫病理学指标、细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫有明显的毒性作用。转Bt cry1Ah基因抗虫玉米对BALB/c小鼠的免疫系统的影响与其亲本玉米基本相同,与其亲本玉米在免疫毒性评价方面具有“实质等同性”。可以认为,转Bt cry1Ah基因抗虫玉米与其亲本玉米在免疫毒性评价方面具是同等安全的。