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目的：
肿瘤抑制基因的表达沉默在胃癌的发生发展中起重要作用,而DNA甲基化是肿瘤抑制基因表达沉默的主要原因之一。本文探讨胃癌细胞中CYGB基因在mRNA水平的表达及与DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的关系。
材料与方法：
一、细胞株
人正常胃粘膜上皮永生化细胞株GES-1和6个胃癌细胞株(SGC7901,BGC823,MGC803,AGS,MKN45,HGC27)。
二、实时定量RT-PCR
上述7种细胞株培养收获后以TRIzol处理并用氯仿一异丙醇提取RNA,用DnaseⅠ去除RNA中的DNA,然后行实时定量RT-PCR检测CYGB的表达,用2-△△Ct法分析实时定量PCR数据,以GES-1中的表达量为相对标准,其他6个细胞株中的表达量与其比较。
三、甲基化特异性PCR
DNA采取经典的有机溶剂法提取,然后行重亚硫酸钠修饰、纯化、回收,回收的DNA用甲基化特异性引物和非甲基化特异性引物分别行甲基化特异性PCR,对PCR结果进行电泳分析,判别每一种细胞株中CYGB基因启动子区的DNA甲基化状态,分非甲基化(U)、部分甲基化(P)、高甲基化(M)三种状态。
四、药物干预实验
以去甲基化药物和/或组蛋白去乙酰化酶抑制剂对MKN45细胞株进行药物干预,以不加任何一种药物的HGC27作为对照组,其他应用任何一种药物的为实验组,完毕提取RNA.并行实时定量RT-PCR检测CYGB的表达,以无药物干预的对照组为相对标准,其他实验组与其比较,用2-△△Ct法分析实时定量PCR数据。
结果：
1、CYGB基因在6株胃癌细胞株中均表达下调,去甲基化药物和组蛋白去乙酰化酶抑制剂均可诱导CYGB在HGC27中的表达,二者联合时诱导作用更强。
2、CYGB基因启动子区的DNA在GES1中为部分甲基化状态,而在6株胃癌细胞株中均为高甲基化状态。
结论：
CYGB基因在胃癌细胞中频繁表达沉默,并且这种表达沉默状态与其启动子区的DNA高甲基化和组蛋白去乙酰化有关,CYGB是胃癌中的候选肿瘤抑制基因。