苯乙烯(Styrene,CAS:100-42-5)是塑料橡胶工业的重要原料,苯乙烯可发生聚合反应生成聚苯乙烯,或与其他单体原料形成共聚物,用以制造各种塑料树脂,合成橡胶。含有苯乙烯的塑料橡胶制品广泛用于日常生活和工业生产,如各种包装材料、隔热材料、一次性饭盒、纸杯、管道、容器等。苯乙烯每年产量巨大,全球产量达3000多万吨,我国2005年产量达125万吨。苯乙烯还存在于某些植物、烟草和汽车尾气中。职业暴露是最有可能引起毒性的情况。作业环境中的苯乙烯主要以气体形式通过呼吸道,或通过皮肤接触进入人体。短时间接触高浓度苯乙烯可引起咳嗽、咽痛等呼吸道刺激症状。长时间接触苯乙烯可引起肺组织结构损害,从而使工人易患肺炎、肺气肿等疾病。苯乙烯是可疑致癌物,但在人体内的致癌性还存在争议。苯乙烯在小鼠,大鼠和人体内外均可发生代谢反应,且存在很大的物种间差异。其中小鼠对苯乙烯的代谢速率最快,其次为大鼠和人。苯乙烯经体内P450酶代谢后主要生成苯乙烯环氧化物(Styrene oxide,SO),苯乙烯环氧化物有较强的氧化性,可引起脂质过氧化,导致细胞氧化损伤。苯乙烯环氧化物同时也是亲电化合物,可与蛋白质、核酸等亲核生物大分子形成共价结合物,引起蛋白质功能的改变和基因突变,从而引起细胞损伤。苯乙烯还可发生苯环羟基化代谢,生成羟基苯乙烯,为苯环乙烯的次要代谢途径。本文从以下三部分研究内容进行深入探讨,为进一步研究苯乙烯的致毒机理打下基础。1.LC/ESI-MS方法检测苯乙烯及1,3-丁二烯代谢物苯乙烯和1,3-丁二烯是塑料和橡胶工业广泛使用的原料。它们主要通过P450酶代谢成为相应的环氧化物,即苯乙烯环氧化物和3-丁烯-1,2-环氧化物。环氧化物通过环氧化物水解酶或自发水解成为相应的二醇,即苯乙二醇和3-丁烯-1,2-二醇。二醇代谢物可以作为苯乙烯和1,3-丁二烯暴露的生物标志物。然而苯乙二醇和3-丁烯-1,2-二醇很难在质谱的ESI离子源内有效离子化,所以无法用ESI-MS检测。而且苯乙二醇和3-丁烯-1,2-二醇紫外吸收强度低,最大吸收波长在低波长处,紫外检测易受到干扰。我们开发了柱前衍生化方法用LC/ESI-MS方法测定苯乙二醇和3-丁烯-1,2-二醇。利用二醇能和硼酸生成硼酸酯的原理,用2-溴吡啶-5-硼酸作为衍生化试剂,使二醇容易离子化,实现苯乙二醇和3-丁烯-1,2-二醇的ESI-MS检测。2-溴吡啶-5-硼酸分子内含有氮元素,可是促进正离子模式下的离子化;2-溴吡啶-5-硼酸含有溴元素,溴元素有天然的两个同位素,因此衍生化产物也有两个同位素,在质谱上表现出两个相互重叠的同位素离子峰,有利于辨别干扰。该衍生化方法操作步骤简便、快速,不但提高了灵敏度,而且可以鉴别二醇化合物。为了进一步评价2-溴吡啶-5-硼酸衍生化其他二醇的能力,我们选取了四个含有不同羟基构象的二醇化合物,测定了它们和2-溴吡啶-5-硼酸的亲和力,发现二醇的构型很大程度上影响到硼酸酯的生成。在环已烷二醇中,顺式二醇比反式构型的有更强的亲和力,而且环的刚性会影响亲和力。2.苯乙烯环氧化物蛋白结合物立体选择性抗体的制备苯乙烯对人和动物有肺毒性和肝脏毒性。苯乙烯环氧化物是主要的致毒代谢中间产物,它能和蛋白质如白蛋白和血红蛋白发生共价结合。苯乙烯环氧化物有两个光学异构体,而且有报道R型的苯乙烯环氧化物比S型的毒性大。我们制备了能够立体选择性的识别苯乙烯环氧化物半胱氨酸残基共价结合物的多克隆抗体。通过将苯乙烯环氧化物对映体分别和巯基化的钥孔帽贝血蓝蛋白(Keyholelimpet hemocyanin,KLH)结合制备免疫用抗原。通过用免疫抗原免疫家兔制备得到多克隆抗体。ELISA结果显示6只家兔都产生了针对苯乙烯环氧化物牛血清白蛋白的抗体,和牛血清白蛋白BSA没有交叉反应。3只用R-抗原免疫的家兔产生的抗血清都有较好立体选择性,而只有1只用S-抗原免疫的家兔有立体选择性。我们进一步用竞争性ELISA和免疫印迹实验验证了抗体的立体选择性,抗体可以识别WI-38细胞经苯乙烯环氧化物暴露后的蛋白结合物。而且应用竞争性ELISA和竞争性免疫印迹方法研究发现,手性中心的羟基是免疫识别所必须的。用Western blot分析了细胞暴露于苯乙烯后的细胞总蛋白,发现苯乙烯环氧化物与蛋白的共价结合缺乏选择性。3.4-羟基苯乙烯在苯乙烯致毒过程中的作用苯乙烯的苯环羟基化是苯乙烯代谢的另一条途径,为苯乙烯的次要代谢途径。在苯乙烯暴露的工人尿液中可以检测到4-羟基苯乙烯(4-VP)。在小鼠和大鼠的苯乙烯体内代谢研究中都发现了4-VP。4-VP占苯乙烯代谢的比例较小,根据报道,在小鼠中4-VP代谢物占苯乙烯总尿液代谢物的6%,大鼠中占1%,人中小于0.1%。但4-VP的体内毒性比SO大。4-VP苯乙烯致毒过程中的地位如何,目前还没有定论。我们通过比较苯乙烯和4-氟取代苯乙烯的体内外毒性和它们的代谢来研究4-VP在苯乙烯致毒的过程中的作用。结果显示,1):苯乙烯和4-氟苯乙烯的体内外毒性在均同一水平;2)在小鼠肝微粒体中,苯乙烯苯环羟基化产物有2-,3-和4-羟基苯乙烯,而4-氟苯乙烯没有检测到苯环羟基化产物,双键环氧化是苯乙烯和4-氟苯乙烯的主要代谢途径;3):小鼠肝微粒体代谢10min后,4-VP的生成速率约为SG的0.07%。因此,我们认为苯乙烯和4-氟苯乙烯的毒性水平相同,而4-氟苯乙烯不能代谢为4-VP;在小鼠肝微粒体,苯乙烯代谢为4-VP的速率低,4-VP在苯乙烯致毒过程中的作用是有限的。初步研究表明,2-,3-和4-羟基苯乙烯在小鼠肝微粒体中快速代谢为二羟基苯乙烯和羟基苯乙烯二醇,且不同底物有不同的产物选择性。