研究背景宫颈癌的发病率在女性生殖系统恶性肿瘤中占第二位,仅次于乳腺癌,全世界范围内每年新增病例数逾50万,其中大部分在发展中国家,我国是宫颈癌大国,每年新增病例数超过13万,因宫颈癌的死亡人数每年有6万之多。近年来,随着HPV疫苗的使用、宫颈癌早期筛查技术方法的开展等一、二级预防方法的应用,其发病率有所降低,但是因为HPV疫苗仍未在世界范围内全面应用,经济落后地区仍未全面开展早期筛查,宫颈癌的死亡率仍居高不下,仍是严重危害妇女健康的疾病之一。众所周知,浸润和转移是导致宫颈癌预后不良的主要原因,因此对其侵袭转移的分子机制进行详细、系统的研究,对开展个体化的靶向干预和治疗具有重大意义。MicroRNAs与肿瘤的关系一直是近年来肿瘤领域研究的热点,microRNAs是一类内源性的非编码单链RNA分子,其长度约在18-25nt之间,通过与靶mRNA的3’非编码区(3’-UTR)互补结合导致mRNA的降解或翻译受抑制而在转录后水平上对基因的表达进行调控,参与一系列的重要生命进程,包括细胞增殖、分化、恶变及凋亡等等。microRNAs调节着人类大约三分之一的基因表达,而且与恶性肿瘤的发生、发展、浸润转移等密切相关。其中microRNA-21(miR-21)是发现较早、研究较多的一种microRNAs,在多种恶性肿瘤组织及细胞中均呈高表达,失调的miR-21通过作用于多种肿瘤抑制因子,如PDCD4、 PTEN、maspin、TPM1、BMPRI、sprouty2等,参与与恶性肿瘤细胞的增生、浸润转移和抗凋亡等生物学行为,miR-21在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥类似癌基因的作用,可被开发为恶性肿瘤治疗的潜在靶点。大量研究表明miR-21在宫颈癌组织中表达是升高的,目前已知高危型人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染是宫颈癌主要发病原因,HPV整合入宿主细胞基因组后,可以导致被整合细胞遗传学的改变而致其癌变。人类的miR-21基因位于染色体17q23.2脆性位点区域FRA17B,此区域恰好是HPV16容易整合的位点,可以推测miR-21基因邻近HPV整合位点处可能与其在宫颈癌中表达水平升高有关还有研究发现,在宫颈癌Hela细胞系中抑制miR-21的表达后,明显抑制Hela细胞的增殖能力。在体外培养宫颈鳞癌细胞系中还发现miR-21可以通过调节其靶基因CCL20的表达,来调节癌细胞的增殖、凋亡及侵袭转移等生物学过程；另外,miR-21的在宫颈癌中的表达量与宫颈癌患者的临床期别及淋巴转移等有关。这些研究充分说明了miR-21与宫颈癌发生发展关系密切,而关于其调控宫颈癌侵袭转移的具体分子机制尚未完全明确。近年来,对于恶性侵袭转移机制的研究取得了较大的进展,目前的共识是：恶性肿瘤的侵袭转移是一个多步骤、多基因调控的复杂的生物学过程,包括肿瘤细胞局部浸润、穿入血管壁、转运、穿出血管壁和远处种植,而上皮间质转化(Epithelial mesenchymal transition, EMT)过程可能是上皮性恶性肿瘤侵袭转移的始发事件。EMT是指上皮细胞获得间质细胞特性,以上皮细胞特征的丧失和间质细胞特性的获得为主要特征,进而诱导上皮细胞获得迁移侵袭的能力,参与了人体许多的生理病理过程,包括胚胎发生、器官分化、组织炎症、创伤愈合等。EMT的特征是细胞的转移和侵袭,当然也就包括了肿瘤细胞的侵袭和转移。已有研究证实,EMT在多种上皮性恶性肿瘤的原发浸润和继发转移中起着关键的作用。microRNAs调节着人类近三分之一的基因表达,其必然也会调控参与EMT过程的相关基因的表达。目前,已有研究证实有多种microRNAs参与调控恶性肿瘤的EMT过程。关于胰腺癌的一项研究发现,miR-200c可正性调控E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,从而抑制胰腺癌细胞的侵袭转移。另有研究发现miR-200通过下调Fas相关磷酯酶-1(FAP-1),从而抑制肿瘤EMT的发生。已知miR-34a是起抑癌作用一种microRNAs,在大多数肿瘤组织中呈低表达,而SIRT1、Notch1和Snail1等作为miR-34a的下游靶基因,也是EMT过程的重要调控因子。最近有一项关于胆管癌的研究中发现miR-21可能通过诱导细胞的EMT过程促进胆管癌细胞的浸润转移。研究已证明miR-21与宫颈癌的浸润转移有关,其具体机制尚未完全明确;EMT过程又在上皮性恶性肿瘤的浸润转移过程中起重要作用；我们推测miR-21是否通过调控宫颈癌细胞的EMT过程,从而促进宫颈癌细胞的侵袭转移,关于这方面研究,目前国内外未见相关的报道。研究目的本研究旨在通过临床组织标本实验探讨miR-21与宫颈癌浸润转移的关系,EMT过程的关键分子与宫颈癌浸润转移的关系,miR-21与EMT过程关键分子之间的关系；通过体外细胞实验进一步验证miR-21对宫颈癌细胞EMT过程及侵袭转移能力的影响,揭示miR-21是否通过调控宫颈癌细胞的EMT过程而影响其浸润转移,为寻找宫颈癌浸润转移的相关目标靶点,阻遏宫颈癌浸润转移过程,开展基因靶向干预和个体化治疗提供实验数据和理论基础。研究材料和方法1.组织标本实验1.1收集45例宫颈癌手术后的新鲜组织标本,标本包括宫颈癌组织及癌旁正常的宫颈组织,若术中发现可疑转移淋巴结组织,一并取下,待病理证实为淋巴结转移癌组织,亦用于实验,最终经病理证实所取淋巴结中,有淋巴结转移癌者15例。采用实时荧光定量PCR法检测miR-21在45例宫颈癌组织和癌旁正常宫颈组织中的相对表达量,同时检测15例淋巴结转移癌灶组织中miR-21的表达量。对比正常组织、癌组织、淋巴结转移癌组织中miR-21的表达差异,分析miR-21的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系。1.2同样的组织标本,利用实时荧光定量PCR法检测宫颈癌组织,正常宫颈组织及淋巴结转移癌组织中EMT相关转录因子ZEB1mRNA的相对表达量差异,分析ZEB1mRNA的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系。同时分析在宫颈癌组织中miR-21与ZEB1mRNA的表达的相关性。1.3免疫组化技术检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中EMT相关蛋白ZEB1蛋白、E-钙粘蛋白、波形蛋白的表达,探讨EMT相关蛋白的表达情况与宫颈癌临床病理特征之间的关系,并分析它们相互之间的关联性,探讨宫颈癌浸润转移过程中是否发生了EMT过程。2.体外细胞实验2.1选择人宫颈腺癌细胞株Hela及鳞癌细胞株Siha作为体外细胞模型,用Lipofectamine 2000法将miR-21 mimic和miR-21 inhibitor转入实验细胞获得稳定表达的细胞株,设阴性及空白对照组,实时荧光定量PCR法测定转染后细胞miR-21的表达量的改变。2.2细胞划痕实验及Transwell实验检测转染后各组细胞的体外迁移侵袭能力的改变,验证miR-21表达量的改变对宫颈癌细胞体外迁移侵袭能力的影响。2.3实时荧光定量PCR法检测改变宫颈癌细胞miR-21表达量后,其EMT相关转录因子ZEB1及snail mRNA的表达差异,Western Blot技术检测EMT相关蛋白E-cadherin、Vimentin、N-cadherin的表达差异,验证在宫颈癌细胞中miR-21对EMT过程关键分子表达的调控作用。结果1.组织标本实验结果1.1实时荧光定量PCR法检测结果显示,miR-21在宫颈癌组织中的相对表达量高于相应的正常宫颈组织(P<0.05),淋巴转移癌组织中的表达量高于原发癌组织(P<0.05)。且宫颈癌组织中miR-21的表达量与宫颈癌肌层浸润深度、淋巴结转移与否、宫旁浸润与否有显著相关性(P<0.05)；与患者年龄、肿瘤大小及病理类型无显著相关性(P>0.05) 另外还发现在HPV16阳性的宫颈癌组织中高于非HPV16阳性的癌组织(P<0.05)。1.2实时荧光定量PCR法检测结果显示,ZEB1 mRNA在宫颈癌组织中的表达高于相对应的正常宫颈组织(P<0.05),淋巴转移癌组织中的表达高于原发癌组织(P<0.05)。且ZEB1mRNA的表达量与宫颈癌肌层浸润深度、淋巴结转移与否有显著相关性(P<0.05)。与患者年龄、肿瘤大小、宫旁浸润与否、病理类型无有显著相关性(P>0.05)。进一步相关性分析发现在宫颈癌组织中miR-21的表达与ZEB1mRNA的表达呈正相关(rs=0.841,P<0.05)。1.3免疫组化结果显示宫颈癌组织中ZEB1蛋白表达高于相对应的正常宫颈组织,与宫颈癌肌层浸润深度、淋巴结转移与否有显著相关性(P<0.05)。与相应的正常宫颈组织相比,E-cadherin在宫颈癌组织中呈低表达,与淋巴结转移与否有显著相关性(P<0.05)。相反,Vimentin在宫颈癌组织中呈高表达(P<0.05),也与宫颈癌淋巴结转移与否有显著相关性(P<0.05)。进一步统计分析发现在宫颈癌组织中ZEB1蛋白的表达与E-cadherin呈负相关(rs=-0.862,P<0.001),与Vimentin表达未呈明显相关性(rs=-0.244,P>0.05)。2.细胞学实验结果2.1体外培养人宫颈腺癌细胞株Hela及鳞癌细胞株Siha,利用脂质体2000成功转染得到稳定表达的细胞,实时荧光定量PCR结果发现,转染miR-21-mimic组的Hela和Siha细胞的miR-21表达量较对照组升高,而转染miR-21-inhibitor后Hela细胞和Siha细胞的miR-21表达量下降。2.2利用划痕实验检测不同组中宫颈癌细胞的体外迁移能力变化,结果显示,Hela-miR-21-mimic组的细胞迁移能力明显高于对照组,Siha-miR-21-mimic组细胞迁移能力也明显高于对照组,而Hela-miR-21-inhibitor组的细胞迁移能力明显低于对照组,Siha-miR-21-inhibitor组的细胞迁移能力明显低于对照组。2.3利用Transwell实验检测不同组中宫颈癌细胞的体外侵袭能力变化,结果显示,Hela-miR-21-mimic组的细胞侵袭能力明显高于对照组,Siha-miR-21-mimic组细胞侵袭能力也明显高于对照组,而Hela-miR-21-inhibitor组的细胞侵袭能力明显低于对照组,Siha-miR-21-inhibitor组的细胞侵袭能力也明显低于对照组。2.4实时荧光定量法检测转染后细胞中EMT相关转录因子ZEB1及snail的mRNA表达量变化,结果显示,Hela-miR-21-mimic组细胞和Siha-miR-21-mimic组细胞的ZEB1及snail mRNA的表达较对照组升高(P<0.05);Hela-miR-21-inhibitor组细胞和Siha-miR-21-inhibitor组细胞中ZEB1及snail mRNA的表达均较对照组降低(P<0.05)。2.5 Western Blot检测转染后细胞内的EMT相关蛋白的表达差异,结果显示,Hela-miR-21-mimic组细胞和Siha-miR-21-mimic组细胞E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、N-cadherin蛋白的表达量升高；Hela-miR-21-inhibitor组细胞和Siha-miR-21-inhibitor组细胞中E-cadherin蛋白表达量升高,而Vimentin、N-cadherin蛋白的表达量均降低。结论1.miR-21在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁正常宫颈组织,在淋巴转移癌组织中高于其原发癌组织,且与宫颈癌肌层浸润深度、宫旁浸润与否、淋巴结转移与否有关,而与患者年龄、肿瘤大小、病理类型无关,提示在宫颈癌组织中,miR-21可能起类似癌基因的作用,促进宫颈癌的发生发展及浸润转移。另外在HPV16型阳性的宫颈癌组织标本中升高,提示miR-21在宫颈癌发生发展中起促进作用可能与HPV16感染关系密切。2.EMT相关转录因子ZEB1 mRNA在宫颈癌组织中的表达高于癌旁正常宫颈组织,淋巴转移癌组织中的表达高于原发癌组织,且ZEB1 mRNA的表达与宫颈癌肌层浸润深度、宫旁浸润与否、淋巴结转移与否有关。免疫组化结果亦显示ZEB1蛋白在宫颈癌组织中高表达,E-cadherin在宫颈癌组织中低表达,Vimentin在宫颈癌组织中呈高表达,且与宫颈癌淋巴结转移与否、肌层浸润深度等有关,提示了在宫颈癌浸润转移过程中可能发生了EMT过程。3.宫颈癌组织中ZEB1蛋白与E-cadherin蛋白的表达情况负相关,miR-21的表达又与ZEB1mRNA的表达呈正相关。体外细胞试验发现增加宫颈癌细胞的miR-21表达量,可以促进了宫颈癌细胞体外的侵袭转移能力；降低宫颈癌细胞的miR-21表达量,抑制了宫颈癌细胞体外侵袭转移能力；miR-21正性调控EMT相关转录因子ZEB1及snail mRNA表达,上调促进EMT的相关蛋白Vimentin、N-cadherin的表达量,下调抑制EMT的蛋白E-cadherin的表达。提示miR-21可能通过调控宫颈癌的EMT过程,进而促进宫颈癌细胞的侵袭转移。