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絮凝的发生依赖于酵母细胞表面絮凝蛋白与邻近细胞表面寡聚甘露糖链的相互结合，Flo1p是非常典型的絮凝蛋白，由FLO1基因编码，该基因中间存在着大量的衔接重复序列，根据编码氨基酸序列的不同，可将这些重复序列分为A、B、C和D四个重复单元。高度重复序列是絮凝基因中非常活跃的成分，它们通过在DNA复制过程中驱动基因内部或基因之间的滑移和重组，导致不断产生新的FLO基因或假基因，结果一方面可能产生絮凝表型的多样性，同时也存在着表型不稳定的严重问题。已有研究发现重复序列单元A拷贝数的改变会导致细胞絮凝能力、絮凝类型的变化、甚至使酵母细胞呈现黏附、生物膜等多种表型。本课题组对FLO1内其他三个重复序列单元B、C和D分别进行了研究，结果表明，重复单元B、C或D分别缺失后，细胞絮凝特性受甘露糖抑制的敏感性降低;同时对环境pH的改变具有更广泛的适应性。利用将絮凝蛋白与GFP蛋白融合表达的方式，发现FLO1基因内重复序列单元C全部缺失增强了絮凝蛋白在环境酸碱变化中的构象稳定性，从而提高了酵母菌絮凝特性对环境酸碱变化的适应性。预示着衔接重复序列对絮凝蛋白的结构和功能具有重要的调控作用。 为了进一步研究衔接重复序列对絮凝蛋白功能的影响，以及蛋白功能变化的结构生物学基础，为构建遗传稳定的最小絮凝功能基因奠定理论基础，本研究在已有工作基础上，开展了如下研究工作: 以完整絮凝基因FLO1为模板，通过融合PCR的方法构建了重复序列单元C不同程度缺失的衍生基因，并在非絮凝型酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中表达，对不同酵母菌株絮凝能力测定结果表明，酵母絮凝对甘露糖浓度及pH的敏感性与重复序列单元C的拷贝数有关，重复序列数量越多越敏感。进一步确证了FLO1内重复序列单元C全部缺失后对絮凝蛋白功能及酵母菌絮凝特性的影响。 通过融合PCR的方法得到FLO1内靠近3端重复序列单元B、C和D全部缺失的衍生基因FLO1bcd，比较FLO1及FLO1bcd在非絮凝酵母细胞中的表达水平及絮凝特性差异，发现与表达完整絮凝基因FLO1的酵母菌株YSF1相比，FLO1内靠近3端重复序列单元全部缺失的酵母菌株YSF1bcd的絮凝强度仅略有降低，而且其絮凝特性对钙离子的依赖性、金属离子的敏感性及乙醇敏感性均没有明显变化，但对环境pH以及温度的变化表现出更广泛的适应性，受甘露糖抑制的敏感性也有所降低。FLO1中重复序列单元B、C和D全部缺失与单独缺失C或D一样可以提高絮凝蛋白的功能稳定性，使酵母细胞在极端酸碱环境下仍然表现出明显的絮凝特性;这些重复序列的完全缺失对其他絮凝特性没有明显影响。因此可以通过重复序列删减策略构建遗传稳定的最小絮凝功能基因，为絮凝特性在发酵工业及环境修复方面的可控应用奠定理论基础。 为了能从结构生物学角度阐明FLO1内衔接重复序列变化对絮凝蛋白功能的影响，进行了FLO1及其衍生基因的异源表达。利用毕赤酵母表达体系成功表达了絮凝蛋白Flo1p以及重复序列单元C全部缺失后的絮凝蛋白Flo1cp。通过测定这两种纯化后的蛋白在不同pH缓冲液中糖基结合活性，重复序列单元C缺失有利于提高絮凝蛋白的构象稳定性，从而使酵母细胞在极端酸碱环境或高糖条件下保持较高的絮凝能力。对Flo1p及Flo1cp蛋白晶体生长条件进行了初筛，在三中不同的沉淀剂条件下有晶体长出，为进一步进行絮凝蛋白结构解析，以及从蛋白结构层面揭示衔接重复序列对蛋白功能影响的研究奠定了基础。