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去醛基棉酚醌(Apogossypolone, ApoG2)是将从锦葵科植物草棉、陆地棉的成熟种子中提取的多酚类物质--棉酚(Gossypol)经过化学结构改造而得到的一种化合物。已有报道显示ApoG2对多种肿瘤具有抑制作用,有望成为一种新型有效的抗肿瘤药物。ApoG2可以抑制胰腺癌、淋巴瘤及胃癌等肿瘤细胞的增殖,但对肝癌细胞的相关研究尚未见报道。本课题主要以人肝癌细胞株SMMC-7721为研究对象,观察ApoG2单用及与化疗药物阿霉素(ADM)联合用药对体外肝癌细胞的增殖抑制作用及对肝癌细胞裸鼠移植瘤模型体内的抑瘤作用,并进一步探讨ApoG2抑制肝癌细胞增殖的相关机理。
方法：体外实验采用WST法检测ApoG2对四种肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、QGY-7703和HepG2的增殖抑制作用,并检测ApoG2、ADM单用或联合用药对SMMC-7721细胞的抑制效应；台盼蓝染色法观察ApoG2和ADM单用或联合用药对SMMC-7721细胞活力的影响；DAPI荧光染色法观察药物作用不同时间后SMMC-7721细胞的变化及凋亡发生情况；应用蛋白质印迹法(Western blot)观察不同药物作用后SMMC-7721细胞中Bcl-2家族蛋白的表达和Caspase-9、Caspase-3等酶活性的变化。
体内实验建立肝癌细胞SMMC-7721裸小鼠移植瘤模型,观察肿瘤生长情况,用ApoG2(100mg/kg和200mg/kg)连续给药4周、ADM(5.5mg/kg)每周一次连续4周、ApoG2与ADM联合给药4周,观察单独给药或联合给药对肿瘤的抑瘤作用。并在单独的PD试验中,在给药一周后处死裸小鼠,选取部分肿瘤及肝脏等重要脏器,HE染色观察移植瘤及脏器的病理情况；原位凋亡TUNEL法检测各组移植瘤肿瘤细胞的凋亡情况。
结果：
体外实验：
1、ApoG2对四种肝癌细胞株SMMC-7721、Bel-7402、QGY-7703和HepG2均具有增殖抑制作用,随着浓度的增加,抑制作用明显加强,呈显著的量效关系,半数抑制浓度分别为17.28±4.71μM、21.61±5.25μM、17.36±4.30μM和30.63±3.82μM,其中ApoG2对SMMC-7721细胞较为敏感。
2、ApoG2与ADM联合作用于SMMC-7721细胞,当抑制率达到50％、75％、90％时联合系数为0.657、0.763、0.911,均小于1.0,具有明显的协同作用。
3、台盼蓝染色显示ApoG2(15μM)作用后SMMC-7721细胞的存活率降低最明显,与对照组比较差异有极显著性意义(P<0.01);ApoG2(10μM)与ADM(0.5μM)联合用药12小时后SMMC-7721细胞的存活率明显降低,与单独用药比较差异有极显著意义(P<0.01)。
4、荧光显微镜观察DAPI染色后的细胞,发现用药后的细胞表现出不同的凋亡特征,如细胞体积缩小,核染色质固缩、边集呈新月形,细胞核裂解为碎块等；ADM组凋亡不多,细胞核多变大。药物处理48小时后凋亡发生最明显,ADM(0.5μM)组凋亡细胞百分率为4.3±1.3％,而ApoG2 5μM、10μM、15μM组凋亡细胞百分率分别为7.0±3.0％、15.0±3.9％、23.3±1.6％,明显高于ADM组,且与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05或P<0.01);ApoG2(10μM)与ADM(0.5μM)联合用药组凋亡百分率为34.8±2.0％,与单独用药组比较凋亡明显增多(P<0.01)。
5、Western blot结果显示,ApoG2浓度为5μM、10μM、15μM作用于SMMC-7721细胞48h后,Bcl-2、Mcl-1及Bcl-x1蛋白条带随着浓度的增加而减少,呈浓度依赖性；与ADM(0.5μM)联合用药后作用更明显,提示ApoG2诱导SMMC-7721细胞凋亡的过程中,Bcl-2、Mcl-1蛋白的表达减少；同时在凋亡过程中起关键作用的Caspase-9,3也有明显降低。
体内实验：
1、ApoG2对人肝癌细胞SMMC-7721裸小鼠移植瘤具有抑制作用,100mg/kg和200mg/kg连续给药28天相对肿瘤增殖率(T/C％)分别为68.8％和67.6％,与ADM联合时可使T/C％达到32.3％(P<0.01)。
2、ApoG2单药或联合用药对裸小鼠体重没有显著影响。HE切片显示联合用药组裸小鼠的肝、脾等重要脏器无病理性改变,但是联合用药组肿瘤出现了大面积坏死和核固缩。
3、TUNEL检测结果显示模型组肿瘤组织中凋亡数目较少,仅为12.80±5.51,其他给药组凋亡数均比模型组多,其中ApoG2(200mg/kg)和ApoG2(400mg/kg)凋亡数分别为24.60±6.98和43.90±15.16,具有剂量依赖性,与模型组比较有统计学意义(P<0.01)：ApoG2(400mg/kg)联合ADM(10mg/kg)组凋亡数为47.45±24.59,比ADM(10mg/kg)组凋亡数19.40±7.96明显增多,与模型组比较有统计学意义(P<0.05)。
结论：
1、ApoG2对体外肝癌细胞株SMMC-7721的生长具有明显的抑制作用,呈一定的量效关系,与ADM联合用药具有协同作用。
2、ApoG2对裸小鼠肝癌SMMC-7721移植瘤具有抑瘤作用,与ADM联合用药可以增强单独用药的抑瘤效应。
3、ApoG2在体内外能够不同程度的诱导肝癌细胞凋亡,其机理可能与下调抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1及Bcl-x1的表达有关。