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奶牛乳腺炎严重危害奶牛健康,造成乳腺损伤,进而影响产奶量和乳品质。大肠杆菌是引起奶牛乳腺炎最为常见的病原微生物之一,其主要毒力因子脂多糖（LPS）可造成乳腺炎性损伤,还可进入血液进而危害机体多个器官的健康。目前临床上应用最多的治疗药物为抗生素,然而其存在着细菌耐药性、药物残留等问题,亟需开发更为符合动物性食品安全和环境生态安全的抗生素替代品。连翘是传统中药,具有清热解毒、消痈散结、疏散风热等功效。连翘酯苷A（FTA）是连翘的主要活性成分之一,现代药理学研究表明,FTA具有抗炎、抗病毒、抗氧化等多种生物活性。本试验以FTA为主要研究对象,以LPS诱导的奶牛乳腺上皮细胞（MAC-T）自噬和凋亡为模型,探讨FTA调控MAC-T细胞自噬和凋亡的作用效果及机制,为新药研发提供试验依据和理论基础。1.LPS对MAC-T细胞自噬和凋亡的影响为了探究LPS对MAC-T细胞自噬和凋亡的影响,采用不同浓度LPS处理MAC-T细胞12 h,采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的LPS对MAC-T细胞存活率的影响,乳酸脱氢酶试剂盒（LDH）检测细胞的损伤,q PCR和Western Blot检测自噬和凋亡相关基因和蛋白的表达,免疫荧光检测自噬斑点数,Hoechst33342染色观察细胞核形态,流式细胞术检测凋亡率。CCK-8和LDH结果显示,LPS可抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖,细胞上清液LDH的含量随着LPS的浓度提高而增加。q PCR和Western blot结果显示,与对照组相比,LPS可提高自噬相关基因和蛋白LC3B、ATG5、ATG7、Beclin-1、p62的表达（p＜0.01）。LPS可诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡,提高BAX和Caspase-3基因和蛋白的表达（p＜0.01）,降低BCL-2基因和蛋白的表达（p＜0.01）。免疫荧光结果显示,与对照组相比,LPS可增加细胞自噬斑点数。流式细胞术和Hoechst 33342染色结果显示,LPS可显著增加MAC-T细胞的凋亡率,细胞核形态异常数目增加。以上结果表明,LPS导致MAC-T细胞的自噬水平上升,促进细胞调亡,抑制MAC-T细胞增殖,细胞损伤加剧。2.LPS基于AMPK/m TOR/ULK1信号通路调控MAC-T细胞的自噬和凋亡为了明确AMPK/m TOR/ULK1信号通路在LPS致MAC-T细胞自噬和凋亡中的作用机制,Compound C（CC）预处理MAC-T细胞2 h后添加LPS（100μg/ml）处理12 h,通过Western Blot检测AMPK/m TOR/ULK1信号通路、自噬和凋亡相关蛋白的表达水平,流式细胞术检测凋亡率。结果显示,与对照组相比,LPS处理MAC-T细胞p-AMPK和AMPK以及p-ULK1和ULK1蛋白表达水平比值极显著升高（p＜0.01）;在LPS（50、100μg/ml）处理下,MAC-T细胞p-m TOR和m TOR蛋白水平表达比值极显著下降（p＜0.01）,但在200μg/ml的LPS处理下,p-m TOR和m TOR蛋白水平表达比值无显著差异。与对照组相比,CC预处理后可使p-AMPK/AMPK和pULK1/ULK1显著下降（p＜0.01）,与LPS组相比,CC+LPS组显著降低了p-AMPK/AMPK、pULK1/ULK1、LC3B、BCL-2蛋白表达水平（p＜0.01）,极显著提升了p-m TOR/m TOR和BAX蛋白表达水平（p＜0.01）。流式细胞术结果显示,与LPS组相比,CC+LPS组细胞凋亡率极显著升高（p＜0.01）。以上结果表明,LPS通过AMPK/m TOR/ULK1信号通路调控MAC-T细胞自噬。CC抑制AMPK活性,降低LPS诱导MAC-T细胞自噬水平,并且促进细胞调亡。3连翘酯苷A对LPS诱导的MAC-T细胞自噬和凋亡的调控作用为了明确FTA在LPS致MAC-T细胞自噬和凋亡中的保护作用,FTA预处理MAC-T细胞12h,LPS（100μg/ml）再处12 h,CCK-8检测FTA对MAC-T细胞的增殖作用及FTA预处理在LPS致MAC-T细胞增殖的作用。免疫荧光检测自噬斑点数,q PCR和Western Blot检测自噬和凋亡相关基因和蛋白表达,流式细胞术检测细胞凋亡率。CCK-8结果显示,FTA预处理后,对MAC-T细胞具有促增殖作用,具有抵抗LPS对MAC-T细胞活力降低的作用;Western Blot和q PCR结果显示,与LPS组相比,LPS+F组LC3B和Beclin-1基因和蛋白水平极显著上升（p＜0.05或p＜0.01）,p62基因和蛋白水平表达极显著下降（p＜0.01）,凋亡相关基因和蛋白BAX蛋白水平显著下降（p＜0.01）,BCL-2基因和蛋白水平显著升高（p＜0.05）,同时极显著提高了p-AMPK/AMPK和p-ULK1/ULK1的蛋白表达水平（p＜0.01）,显著下调p-m TOR/m TOR的蛋白表达水平（p＜0.05）;免疫荧光结果显示,与对照组相比,FTA预处理可显著增加自噬斑点数目;流式细胞术显示,与LPS组相比,FTA预处理显著降低了细胞凋亡率。上述结果表明,FTA可经AMPK/m TOR/ULK1通路调控自噬和凋亡,对MAC-T细胞起到保护性作用。为了验证FTA对MAC-T细胞自噬和凋亡的调控作用是经AMPK/m TOR/ULK1通路实现,用CC预处理MAC-T细胞2 h,加入FTA处理12 h,再添加LPS培养12 h。采用Western Blot检测自噬、凋亡和炎症相关蛋白的表达。结果显示与LPS+F组相比,LPS+F+CC组LC3B和BCL-2极显著降低（p＜0.01）,p62、BAX、IL-1β、IL-6、p-NFκB/NFκB、p-IKB/IKB显著升高（p＜0.01或p＜0.05）。表明CC沉默AMPK通路可以阻断FTA缓解LPS诱导MAC-T细胞p62蛋白的累积,自噬受抑制,细胞凋亡和炎性损伤加剧。综上所述,LPS可以引起MAC-T细自噬和凋亡水平升高,引起自噬流阻滞,促进细胞凋亡。LPS可通过AMPK/m TOR/ULK1通路去调控MAC-T细胞自噬和凋亡。FTA可以减少LPS引起的自噬流阻滞,促进自噬流顺畅,在LPS致MAC-T细胞自噬和凋亡的过程中起到了保护性作用。FTA主要是通过AMPK通路来调节MAC-T细胞自噬和凋亡相关进程。