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红系分化相关基因（Erythroid Differentiation Associated Gene, EDAG）是利用代表性差异显示技术，自人胎肝中克隆分离出的新基因。EDAG特异表达于不同发育时期的造血组织，高表达于造血干/祖细胞以及红系前体细胞，在成熟血液细胞中不表达。EDAG促进造血细胞的增殖、抑制凋亡，并参与调节细胞分化，对造血干细胞的谱系分化平衡起重要作用。EDAG与红系分化重要的转录因子GATA1存在正反馈调控机制，能上调GATA1表达，促进GATA1下游红系相关靶基因的转录，进而使细胞出现红系表型。但前期研究主要集中在体外细胞系以及转基因小鼠模型中，EDAG对人原代造血干细胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）的增殖、分化以及造血重建能力的影响尚未明确。本论文以富含造血干/祖细胞的健康产妇脐带血CD34~+细胞为研究对象，研究EDAG对造血干细胞增殖、分化及存活能力的影响。第一， EDAG促进CD34~+细胞在体外向红系分化。首先检测EDAG在骨髓造血干/祖细胞不同亚群中的表达情况，发现与造血干细胞（HSC）相比，EDAG在髓系祖细胞（CMP）、红系-巨核系祖细胞（MEP）中高度富集，而在淋巴系祖细胞（CLP）中则表达极低；进一步检测EDAG在红系分化过程中的表达变化情况，发现在CD34~+细胞经半固体培养基培养而得的BFU-E、CFU-E中以及CD34~+细胞在液体培养基诱导红系分化过程中， EDAG表达均显著上调，提示EDAG在HSC红系分化过程发挥调控作用。为进一步检测EDAG在红系分化中的作用，构建了过表达EDAG的慢病毒载体以及针对EDAG的RNAi慢病毒载体，并分别包装成慢病毒颗粒；经检测，慢病毒对人原代脐血CD34~+细胞具有较高的感染效率（40%以上）。过表达EDAG可促进CD34~+细胞在液体培养基中向红系分化，表现为CD71~+GPA~+双阳性细胞，特别是CD71~+GPAint细胞比例增高，联苯胺染色阳性细胞增多。在半固体培养体系下，过表达EDAG的CD34~+细胞形成总集落（CFC）数量增多，其中红系集落BFU-E比例增高；收取细胞进行二次接种，BFU-E比例进一步增高。同时，在过表达EDAG的细胞集落中，GATA1及其下游红系相关靶基因表达上调。另一方面，敲低EDAG降低CD71~+GPA~+细胞以及联苯胺染色阳性细胞比例；在半固体培养条件下，敲低EDAG后CD34~+细胞集落形成能力降低，BFU-E比例下降。敲低EDAG后GATA1及其下游红系相关靶基因表达下调。进一步对EDAG促进红系分化的机制进行研究，发现缺失与GATA1相互作用的N端或缺失与p300相互作用的C端，EDAG均丧失促进红系分化的活性，表明EDAG促进红系分化依赖于EDAG/GATA1/p300复合体的形成。同时，在红系诱导过程中加入p300乙酰转移酶活性特异抑制剂C646，流式分析及联苯胺染色实验均表明EDAG促进红系分化的功能丧失，表明p300酶活性在EDAG发挥促红系分化功能中起关键作用。同时发现在红系分化过程中，过表达EDAG促进CD34~+细胞增殖，并抑制由于撤除EPO诱导的细胞凋亡；敲低EDAG后CD34~+细胞增殖减缓，撤除EPO后细胞凋亡增加。进一步利用基因芯片分析在CD34~+细胞向红系分化过程中，敲低EDAG后基因表达谱变化，并与GATA1的靶基因进行比对。发现EDAG正调控GATA1转录激活的红系靶基因，而对GATA1转录抑制的靶基因没有影响或存在正调控作用，提示EDAG对GATA1的靶基因存在选择性调控机制；进一步分析发现EDAG还调控了大量并不被GATA1调控的基因群，提示EDAG对红系分化的调控可能还存在新的未知机制。第二，利用HSC移植模型证实在体内EDAG促进CD34~+细胞向红系发育。首先在受体小鼠品系、照射条件以及用于移植的细胞处理三个方面对造血干细胞移植模型的建立进行条件优化。最终确定，利用NOD/SCID/IL2null小鼠作为受体；移植前接受两次、共2.5Gy剂量的X射线照射；利用新鲜分离的脐血CD34~+细胞，不经过冻融，并在分离后72小时内完成2次慢病毒感染以及移植，能达到较高的嵌合率，并能检测到向红系发育的细胞。利用构建的造血干细胞移植模型，在脐血CD34~+细胞过表达EDAG后经尾静脉注射移植入受照受体小鼠，并在移植后第4周检测细胞发育情况。结果显示与对照组相比过表达EDAG后CD71~+GPA~+细胞比例增高，表明过表达EDAG促进细胞向红系发育，与体外实验结果一致。同时发现过表达EDAG后CD34~+细胞比例及CD11b~+细胞比例均有所增高，提示EDAG可能还参与了HSC的自我更新及定向分化的调节。第三，体外扩增培养过程中EDAG促进CD34~+细胞增殖、抑制凋亡，并且维持细胞处于细胞周期。在扩增培养条件下，过表达EDAG提高CD11b~+比例，对其他谱系表面标志无明显影响，表明在体外过表达EDAG促进细胞向髓系分化。同时发现过表达EDAG后CD34~+细胞比例下降缓慢，提示过表达EDAG有助于造血干细胞特性的维持，这与体内结果一致。进一步研究发现过表达EDAG促进CD34~+细胞增殖，并抑制撤除细胞因子诱导的细胞凋亡；相应地，敲低EDAG后CD34~+细胞增殖缓慢，撤除细胞因子后凋亡增加。同时发现过表达EDAG维持CD34~+细胞处于细胞周期：过表达EDAG后处于G0期细胞减少，进入细胞周期（G1/S/G2/M）的细胞增多。相应地，敲低EDAG则使G0期细胞比例增加，进入细胞周期的细胞减少。这些结果表明EDAG促进CD34~+细胞增殖，提高细胞存活能力，并调控细胞周期进程。综上，本研究利用体外、体内模型证实EDAG是一种新的红系分化正调控因子，可通过与GATA1/p300形成复合体促进红系分化。此外，EDAG还可调控CD34~+细胞增殖、存活与细胞周期进程，提示EDAG可能参与了HSC的自我更新。