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DNA磷硫修饰是最新被发现的第一类发生在DNA骨架上的生理修饰,其是由dnd基因编码的DndA、DndB、DndC、DndD、DndE蛋白所调控。生物信息学分析DndE蛋白可能是一类NCAIR合成酶的同源蛋白或者一种PAPS硫转移酶的同源蛋白,这种功能推测上的模糊性为进一步开展DNA磷硫修饰的研究带来了巨大的挑战。因此为了解决这一难点,并准确阐述DndE蛋白的生理功能,本论文选择DndE蛋白作为研究对象。为了研究DNA磷硫修饰在物种上的保守性和进化性,我们选择了来源于EscherichiacoliB7A,Salmonellaentericasubsp.entericaserovarSaintpaulstr.SARA23a,Streptomyceslividans66三种物种的DndE蛋白作为进一步的研究对象。首先摸索了这三种DndE蛋白的表达纯化条件,最终发现当利用pSMT3载体进行异源表达与纯化的时候,才能获得比较稳定的DndEB7a-N110、DndEsalm-full、DndEN-flag-livdan蛋白。我们对其开展了NMR研究,却发现三种DndE蛋白均存在构象不均一,多聚现象等,且这种多聚与DndE蛋白的浓度有关系。为了改善谱图质量,我们采用多种方法对其进行了优化,最后发现只有DndEB7a-N110蛋白在Tris缓冲液,pH7.9的条件下构象才比较均一,但是令人遗憾的是在该条件下DndE蛋白仍然存在多聚现象,无法利用NMR方法对其进行进一步的结构解析。
鉴于此,我们寻求利用X-ray方法对DndE蛋白进行结晶学研究。通过对三种DndE蛋白进行结晶筛选和晶体优化,以及衍射数据的收集和处理,我们最终获得了精修质量完好的DndEB7a-N110的晶体结构和初步的DndEsalm-full结构。从晶体结构来看,DndE蛋白利用两种不同形式的二聚体,进一步聚合成四聚体。此外研究还发现,在DndEB7a-N110四聚体结构上存在两种不同形式的凹槽以及一个正电荷空洞,分析这有可能是DndE蛋白在体内结合其底物所需要的活性位点。比较了DndE蛋白结构与NCAIR合成酶结构,以及PAPS硫转移酶的结构,DndE蛋白与这两种蛋白无结构同源性。体外等温热量滴定实验(IsothermalTitrationCalorimetry,ITC)验证了这一结论,据此推测DndE蛋白可能是一种新颖的未知功能蛋白。结构同源性搜索,发现DndE蛋白可能是一种骨架新颖的DNA结合蛋白。为了验证这一点,我们设计了包含荧光素标记(FAM)标记的五种DNA,利用荧光偏振实验(fluorescencepolarization,FP)对其开展研究,最终证实了DndE蛋白是一类骨架新颖的缺口双链(nickeddsDNA)结合蛋白,且这种结合是一种非特异性结合,微弱强于序列特异性双链DNA。定点突变实验以及荧光极化实验实验证实了位于DndE蛋白表面的K20、K18、K87,、K91、K53、K17等正电荷残基均不同程度的参与序列特异性双链DNA以及缺口双链DNA的识别。此外Dnd表型实验进一步证实了在DNA磷硫修饰过程中DndE蛋白是通过其表面带正电荷的氨基酸参与对缺口双链DNA或者序列特异性的正常双链DNA(dsDNA)的识别。因此我们推测DndE蛋白对DNA的识别在DNA磷硫修饰过程中,可能起到预先搜索或者转移序列特异性DNA修饰位点的作用,然而这有待进一步的体内功能实验的验证。
为了进一步阐述在DNA磷硫修饰中DndE蛋白对缺口双链DNA的识别机制,我们尝试利用X-ray的方法解析出DndE-dsDNA以及DndE-nickeddsDNA复合物的晶体结构。为此我们对DNA的种类、粘性末端、长度以及核心碱基作了深入的筛选和优化,最终无法获得衍射质量良好的单晶。目前我们一方面进一步优化现有的结晶条件,一方面寻求在既不影响Dnd表型又能使DNA结合能力增强的DndE蛋白突变体,从而获得获得‘DndE-dsDNA’和‘DndE-nickeddsDNA’复合物的晶体结构,最终阐述在DNA磷硫修饰中DndE蛋白对缺口双链DNA(nickeddsDNA)的识别机制。