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研究背景及目的G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCRs)是目前已知最大的细胞膜表面受体超家族,可将胞外的多种信号分子(如气味、光、多肽、脂质、激素等)传至细胞内部,从而调节和维持生物体的稳态。GPCRs在人体内广泛表达,其信号传导通路的失调与多种疾病的发生发展密切相关。目前,临床上超过50%的药物以GPCRs作为靶点。GPCRs与配体结合后激活并启动细胞内的信号传导途径。除了传统的G蛋白依赖的信号通路,活化的GPCRs与许多胞内其他蛋白结合增加了信号传导的多样性,这些蛋白包括G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases, GRKs)和p-抑制蛋白(P-arrestin)。在此过程中,配体的结合引起GPCRs发生磷酸化,随后胞内的β-arrestin被募集到GRKs磷酸化的受体。作为细胞内的信号衔接蛋白和支架蛋白,β-arrestin在GPCRs的脱敏、内吞、运输过程中发挥重要的作用,并以G蛋白非依赖的方式传导下游的信号瀑布。Apeli n是Tatemoto等利用反向药理学方法从牛胃分泌物中提取并纯化出的一种新的心血管活性肽,为孤儿G蛋白偶联受体—血管紧张素受体AT1相关的受体蛋白(putative receptor protein related to the angiotensin receptor AT1,APJ)的内源性配体。Apelin/APJ系统在体内广泛分布,参与机体多种生理功能的调节。Apelin/APJ系统有望成为心衰、高血压和糖尿病的治疗靶点。APJ受体的信号传导机制目前仍在研究之中。不同的刺激方式激活APJ受体后,G蛋白依赖的和G蛋白非依赖的信号途径在心肌肥厚的发病过程中发挥双重功能。与大多数GPCRs相似,APJ受体羧基末端结构域的磷酸化或棕榈酰化对受体的脱敏和内吞发挥重要作用。但是,APJ受体如何调节G蛋白依赖的或G蛋白非依赖的信号通路,目前并不清楚。APJ受体的羧基末端存在多个可能的磷酸化位点,其功能尚有待观察。本研究旨在阐明APJ羧基末端确切的磷酸化位点,观察这些位点对APJ受体的脱敏、内吞和G蛋白非依赖的信号途径的影响,进而为心血管系统药物的筛选提供新的实验依据和思路。研究方法1.细胞培养和转染：采用人胚胎肾细胞(HEK293)作为研究对象；脂质体Lipofectamine 2000为转染试剂转染细胞。2.质谱检测：提取APJ受体蛋白,通过烷基化和富集处理后,LC-MS/MS质谱分析APJ受体的磷酸化位点。3.点突变及真核表达载体的构建：重叠延伸PCR技术将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代；限制性内切酶EcoRI和Xho I双酶切扩增产物和载体、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、基因测序鉴定,构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体。4.酶联免疫吸附实验：检测细胞膜表面野生型APJ受体及APJ突变体的表达量；检测细胞内cAMP的含量。5.放射性配体结合实验：检测野生型APJ受体或构建的APJ突变体与配体的结合力。6.激光共聚焦共聚焦实验：检测野生型APJ受体及APJ突变体在细胞膜表面的定位及受体内吞过程。7.剂量反应和实时动态BRET实验：检测野生型APJ受体或APJ突变体与GRK2/5或β-arrestin1/2相互作用的剂量反应和实时动态关系。8.免疫共沉淀实验：检测APJ受体与β-arrestin1或β-arrestin2之间的相互作用。9.细胞内钙离子检测实验：Fluo-4 NW检测激动剂刺激对细胞内钙离子含量变化的影响。10.Western blot实验：检测激动剂对细胞内ERK1/2磷酸化水平的影响。11.统计学分析：所有数据采用均数士标准误(Mean±SEM)表示,采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析。研究结果1.APJ受体羧基末端磷酸化位点的鉴定NetPhos 2.0分析软件预测APJ受体蛋白序列的磷酸化位点分别为ser 335、ser345和ser 348。随后,质谱分析法明确apelin-13刺激后,APJ受体确定的磷酸化位点为ser 345和ser 348。2.APJ受体突变体真核表达载体的构建将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代。构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体,测序证实突变体重组质粒构建正确。3.野生型APJ受体和APJ受体突变体的亚细胞定位分析ELISA和BRET实验发现APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体与野生型APJ受体表达量相当,点突变对APJ受体的细胞膜表面表达没有产生明显的影响,差异无统计学意义。4.野生型APJ受体或APJ受体突变体对配体结合力的影响放射配体结合分析技术证实APJ受体羧基末端磷酸化位点的突变并不影响配体的结合。至少,ser335、345和348并不是apelin-13结合的关键位点。5.野生型APJ受体和APJ受体突变体的功能鉴定稳定表达野生型APJ受体或APJ受体突变体的HEK293细胞中,APJ-S335A、 APJ-S345A和APJ-S348A三种突变体都以剂量依赖性的方式抑制了弗司可林(forskolin,FSK)诱导的cAMP生成。同样,apelin-13均能诱导三种突变体胞内Ca2+释放的显著性增加,与野生型APJ受体基本一致。6.APJ受体丝氨酸348位点对apelin-13诱导的受体内吞的影响在稳定表达APJ受体的HEK293细胞,apelin-13(100nM)刺激5 min后受体内吞开始。激动剂作用30 min,大约有50%的受体离开细胞膜表面发生内吞。激动剂持续60 min后,大约70%的受体回到细胞膜表面。与野生型APJ受体比较,apelin-13诱导的APJ-S335A和APJ-S345A突变体内吞没有发生明显改变。然而,ser348位点的突变使受体的内吞作用受到明显抑制。激光共聚焦实验发现,野生型APJ受体和APJ-S335A、APJ-S345A、 APJ-S348A突变体清晰的表达在细胞膜的表面。激动剂的作用下,APJ-S335A和APJ-S345A突变体的内吞过程与野生型受体相似。然而,在apelin-13的刺激下,APJ-S348A突变体失去了向胞浆移位的能力,不能与胞浆中的β-arrestin1或P-arrestin2蛋白发生共定位。7. APJ受体丝氨酸348位点对GRK2/5或p-arrestinl/2集的影响BRET2检测apelin-13对APJ与G RK2/5相互作用的剂量反应关系。研究表明,GRK2被招募到激动剂活化的受体。EC50值分别为：6.58±0.58nM(WTAPJ), 6.20±1.56 nM(APJ-S335A),5.69±1.42 nM(APJ-S345A)。同样,APJ与GRK5相互作用的ECso值分别为：9.45±2.58 nM(WT APJ),8.20±1.85 nM (APJ-S335A),7.34±1.17nM(APJ-S345A).然而,在不同浓度激动剂的作用下,APJ-S348A突变体均失去了与GRK2或GRK5相互作用的能力。BRET1检测apelin-13对APJ与β-arrestin1/2相互作用的剂量反应关系。研究表明,β-arrestin1与野生型受体或突变体相互作用的ECso值分别为：5.69士0.71nM (WT APJ),5.06±1.05 nM(APJ-S335A),5.55±0.94 nM(APJ-S345A)。 β-arrestin2与野生型受体或突变体相互作用的ECso值分别为：8.29±1.25nM(WT APJ),7.25±0.73 nM(APJ-S335A),7.55±1.03 nM (APJ-S345A)。APJ-S348A突变体均失去了与β-arrestinl或β-arrestin2相互作用的能力。免疫共沉淀实验发现只有在FLAG-β-arrestin1 (或FLAG-β-arrestin2)和HA-APJ共转染的细胞样品中,显示出HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应的条带。而在FLAG-β-arrestin1(或FLAG-β-arrestin2)和HA-APJ-S348A共转染的细胞样品及对照组中,均未发现HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应免疫条带。8.APJ受体丝氨酸348位点对受体脱敏和复敏的影响受体脱敏实验发现,稳转APJ受体的HEK293细胞,apelin-13预处理3h诱导受体持续脱敏,胞内cAMP表达下降。然而,APJ-S348A稳转细胞未表现出激动剂诱导的受体脱敏和cAMP浓度的下降。受体复敏实验发现,100 nM apelin-13预处理APJ稳转细胞3h(诱导受体最大程度脱敏),洗脱激动剂,使细胞静置30 min后,大约有70%的受体重新回到细胞膜表面,而细胞静置2h后,几乎全部受体完成复敏过程。然而,APJ-S348A稳转细胞未观察到这一动态改变。9.APJ受体丝氨酸348位点对G蛋白结合的影响在共转染EGFP-APJ和Rluc-Gaq的HEK293细胞,apelin-13诱导快速明显增加的BRET信号,BRET信号在激动剂作用5 min达到峰值,随后迅速下降。APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体观察到了同样的结果。同样,在共转染EGFP-APJ和Rluc-Gαi2的HEK293细胞,野生型APJ受体和三种突变体都能募集Gαi2蛋白到活化的受体。10.APJ受体丝氨酸348位点对ERK1/2信号途径的影响时间依赖的ERK1/2磷酸化实验显示：HEK293-APJ细胞中,apelin-13作用2 min后,ERK1/2开始激活,最大激活在5 min,在60min内ERK1/2依然处在高水平的磷酸化状态。相比较,在HEK293-APJ-S348A细胞中,apelin-13作用5 min后,ERK1/2的磷酸化与野生型受体相似。然后,在激动剂作用15 min后,ERK1/2的磷酸化快速下降到基础水平。浓度依赖的ERK1/2磷酸化实验显示：不同浓度的apeli n-13作用15 min, HEK293-APJ细胞表现出浓度依赖的ERK1/2磷酸化。然而,激动剂作用HEK293-APJ-S348A细胞相同的时间,各种浓度的apelin-13均未诱导出ERK1/2的磷酸化。继而缩短激动剂的作用时间,观察apelin-13刺激5min, HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞引起ERK1/2磷酸化的剂量依赖关系,结果并未发现两组细胞表现出统计学的差异。PTX预处理阻断Gai/o蛋白后,结果发现HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞,apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化均表现出明显的降低。转染特异的shRNA抑制胞内的β-arrestin表达,观察apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化过程。结果发现,转染shRNA对照组的HEK293-APJ细胞,apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化与未转染组完全一致。然而,HEK293-APJ细胞分别转染P-arrestinl shRNA或β-arrestin2 shRNA, apelin-13作用15 min后的ERK1/2磷酸化水平明显降低。HEK293-APJ348细胞中转染β-arrestin shRNA后,apelin-13诱导的晚期ERK1/2磷酸化同样处于极低的水平,与野生型受体比较无显著性差异。结论APJ受体的348位氨基酸是GRKs和β-arrestin结合的关键位点,其突变影响了受体的脱敏、内吞、复敏过程以及G蛋白非依赖的ERK1/2磷酸化。然而,APJ受体ser348位点的突变并不影响G蛋白的活化以及G蛋白下游的信号通路。因此,APJ-S348A突变体表现出偏向性受体的特性,其产生的偏向性信号有助于新的药物设计和研发。