“阴阳分治法”是根据发作期癫痫不同病机属性,分为阴痫和阳痫两型进行治疗的一种中医疗法。这种辨治方法最早由元代巢元方提出。后来,元代危亦林《世医得效方》提出用五生饮治疗阴痫,清代程国彭《医学心悟》提出用定痫丸治疗阳痫,至此阴阳分治法基本确立。时至今日,已历经700多年的临床验证。目前《中医内科学》教材已将五生饮合二陈汤列为治疗阴痫的代表方,黄连解毒汤合定痫丸列为治疗阳痫的代表方。由于这些方剂中含有生南星、生半夏、生白附子、生川乌、朱砂等多味毒性药物,当今临床应用较少。在癫痫的中医药基础研究中,目前国内使用的动物实验模型均是单纯的西医病理模型,尚未建立符合中医证候特点的癫痫动物模型。本研究分为临床研究和实验研究两部分。其中,实验研究又分为动物实验研究和细胞培养实验研究两节。目的是探讨阴阳分治法的抗痫疗效、安全性及作用机理,同时建立阴痫和阳痫两个中医证候癫痫动物模型。第一部分阴阳分治发作期癫痫的临床研究目的：观察阴阳分治法治疗发作期癫痫的临床疗效及安全性。方法：将入院当天癫痫发作≥3次的癫痫患者随机分为治疗组与对照组,对照组仅给予常规抗痫西药治疗,治疗组给予常规抗痫西药的同时,按阴阳分治法辨证口服中药(阴痫予减味五生饮合二陈汤,阳痫予黄连解毒汤合定痫丸)及醒脑静注射液静滴。通过治疗前后癫痫发作次数减少率、中医证候评价、抗癫痫西药平均总用量及NHS3、MRS、MBI等多种量表进行评价。结果：共纳入合格受试者12例,有11例完成治疗方案,其中对照组5例,治疗组6例,脱落1例。治疗组与对照组治疗前后癫痫发作次数减少率、抗癫痫西药平均总用量及NHS3、MRS、MBI等量表得分比较均无统计学意义。中医证候评价结果显示,对照组改善闭证疗效较好(P<0.05),治疗组改善风、闭、肾阴虚、痰、脾气虚等证疗效较好(P<0.05),其中以痰证、脾气虚证最显著(P<0.01)。治疗组所有病例未见药物不良反应。结论：阴阳分治法可能能够较好地改善发作期癫痫患者中医证候,其中以痰证和脾气虚证效果最好,且未见不良反应。第二部分阴阳分治发作期癫痫的实验研究第一节动物实验研究一、实验一：减味五生饮合二陈汤治疗阴痫型癫痫大鼠的实验研究目的：建立阴痫型癫痫大鼠模型,探讨减味五生饮合二陈汤的抗痫疗效和机理。方法：长期予大鼠喂饲高脂饲料及寒性中药稀释煎液,并以匹罗卡品致痫,以制作阴痫型癫痫大鼠模型。以治疗阴痫的代表方减味五生饮合二陈汤治疗阴痫型癫痫大鼠,同时以治疗阳痫的代表方黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)为对照,记录癫痫发作潜伏期和到达癫痫持续状态(SE)时间；高效液相色谱(HPLC)法检测脑内氨基酸神经递质；HE染色切片观察病理变化；免疫组化技术半定量分析caspase-3表达情况,以评价建模质量及探讨减味五生饮合二陈汤的抗痫疗效和机制。结果：与正常对照组比较,各致痫组大鼠脑内谷氨酸(Glu)、天门冬氨酸(Asp)、γ-氨基丁酸(GABA)、甘氨酸(G1y)、丙氨酸(A1a)等氨基酸类神经递质浓度均下降,caspase-3表达量均上升,其中以阴痫中药组变化幅度最小,阴痫中药对照组次之,但均无统计学意义。各致痫组大鼠癫痫发作潜伏期和到达SE时间比较均无统计学意义。各组癫痫大鼠大脑皮质、海马、肺、肝、肾等组织均出现较严重损伤,但组间比较无明显差异。结论：本实验初步建立了阴痫型癫痫大鼠模型。减味五生饮合二陈汤及黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)均可抑制阴痫型癫痫大鼠脑内Glu、Asp、GABA、Gly、Ala等氨基酸类神经递质的下降及caspase-3的表达,其中以减味五生饮合二陈汤作用较强,提示这些方剂均可能对阴痫型癫痫大鼠具有一定的治疗作用,其中可能以减味五生饮合二陈汤疗效较佳。二、实验二：黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)治疗阳痫型癫痫大鼠的实验研究目的：建立阳痫型癫痫大鼠模型,探讨黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)的抗痫疗效和机理。方法：长期予大鼠喂饲高脂饲料及热性中药稀释煎液,并以匹罗卡品致痫,以制作阳痫型癫痫大鼠模型。以治疗阳痫的代表方黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)治疗阳痫型癫痫大鼠,同时以治疗阴痫的代表方减味五生饮合二陈汤为对照,记录癫痫发作潜伏期和到达SE时间；HPLC法检测脑内氨基酸类神经递质；HE染色切片观察病理变化；免疫组化技术半定量分析caspase-3表达情况,以评价建模质量及黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)的抗痫疗效和机制。结果：与正常对照组比较,各组致痫大鼠脑内Glu、Asp、GABA、Gly、Ala等氨基酸类神经递质浓度均下降,caspase-3表达量均上升,其中阳痫中药组Asp、Ala下降幅度及caspase-3上升幅度在各组中最小,阴痫中药对照组各种氨基酸类神经递质浓度下降及caspase-3上升幅度最大,但均无统计学意义。各致痫组大鼠癫痫发作潜伏期和到达SE时间比较均无统计学意义。各组致痫大鼠大脑皮质、海马、肺、肝、肾等组织均出现较严重损伤,但组间比较无明显差异。结论：本实验初步建立了阳痫型癫痫大鼠模型。黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)可抑制阳痫型癫痫大鼠脑内Glu、Asp、GABA、Gly、Ala等氨基酸类神经递质的下降及caspase-3的表达,提示其可能对阳痫型癫痫大鼠有一定的治疗作用。减味五生饮合二陈汤可促进阳痫型癫痫大鼠脑内Glu、Asp、GABA、Gly、Ala等氨基酸类神经递质的下降及caspase-3的表达,提示其可能会加重阳痫型癫痫大鼠的病情。第二节细胞培养实验研究一、实验一：谷氨酸损伤PC12细胞模型的建立实验研究目的：探讨Glu损伤PC12细胞模型的建立方法。方法：以不同浓度的Glu作用PC12细胞,分别于24小时、48小时和72小时三个时间点观察细胞形态学；MTT法检测细胞活力,以确立Glu对PC12细胞活力影响的量效及量时关系,探讨合适的造模时间及浓度。结果：细胞形态的观察结果显示,在同一时间点中,自5mMGlu组开始,随Glu浓度的升高,细胞折光性及立体感逐渐下降,轮廓逐渐模糊,生长逐渐稀疏,但不同时间点同一Glu浓度组的细胞形态未发现有明显差别。细胞活力检测结果显示,与正常对照组比较,24小时、48小时和72小时三个时间点均自Glu浓度为5mM开始,随着浓度的逐渐升高,细胞活力逐渐下降。除40mM组外,正常对照组和各不同浓度的Glu模型组细胞随着培养时间的延长,细胞活力逐渐增加,即Glu对PC12细胞的活力存在剂量、时间依赖作用：细胞活力随Glu浓度的递增而下降,随培养时间的延长而上升。浓度为10mmol/L以上的Glu处理PC12细胞,在24小时、48小时和72小时三个时间点,其细胞活力与正常对照组比较均显著降低(P<0.01)。结论：Glu对PC12细胞的作用呈剂量和时间依赖关系：细胞活力随Glu浓度增高而降低,随培养时间延长而增强。10mmol/L的Glu作用PC12细胞24小时可能是建立Glu损伤PC12细胞模型较理想的实验条件。二、实验二：减味五生饮合二陈汤含药血清对谷氨酸损伤PC12细胞治疗作用的实验研究目的：在细胞水平上进一步探讨减味五生饮合二陈汤的抗痫疗效和机理。方法：将实验细胞随机分为6组,分别是正常对照组、Glu损伤模型组、正常大鼠血清组、寒痰型大鼠血清组、阴痫中药对照血清组、阴痫中药血清组。以长期喂饲高脂饲料及寒性中药稀释煎液的方法建立“寒痰”型体质大鼠,并以这些大鼠制作的减味五生饮合二陈汤含药血清处理Glu损伤PC12细胞模型,同时以黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)含药血清为对照。MTT法检测细胞活力；流式细胞技术检测细胞内游离Ca2+浓度。结果：与正常对照组比较,各组细胞活力均下降,其中以阴痫中药血清组下降幅度最小,阴痫中药对照血清组次之,除阴痫中药血清组外,均有显著差异(P<0.01)。阴痫中药血清组与阴痫中药对照血清组比较亦有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组比较,除G1u损伤模型组细胞内游离Ca2+浓度升高外,各组均下降,以阴痫中药血清组最低,阴痫中药对照血清组次之。其中,Glu损伤模型组、阴痫中药对照血清组、阴痫中药血清组与正常对照组比较均有显著差异(P<0.01)。阴痫中药血清组与中阴痫中药对照血清组比较亦有显著差异(P<0.01)。结论：以“寒痰”型体质大鼠制作的减味五生饮合二陈汤含药血清及黄连解毒汤合定痫丸含药血清均能提高Glu损伤PC12细胞活力及减少Ca2+内流,提示上述方剂的含药血清可能均有治疗Glu损伤PC12细胞的作用,其中可能以减味五生饮合二陈汤含药血清疗效较佳。三、实验三：黄连解毒汤合定痛丸(汤剂)含药血清对谷氨酸损伤PC12细胞治疗作用的实验研究目的：在细胞水平上进一步探讨黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)的抗痫疗效和机理。方法：将实验细胞随机分为6组,分别是正常对照组、Glu损伤模型组、正常大鼠血清组、痰热型大鼠血清组、阳痫中药对照血清组、阳痫中药血清组。以长期喂饲高脂饲料及热性中药稀释煎液的方法建立“痰热”型体质大鼠,并以之制作的黄连解毒汤合定痫丸(汤剂)含药血清处理Glu损伤PC12细胞模型,同时以减味五生饮合二陈汤含药血清为对照。MTT法检测细胞活力；流式细胞技术检测细胞内游离Ca2+浓度。结果：与正常对照组比较,各组细胞活力均下降,其中以阳痫中药对照血清组下降幅度最小,阳痫中药血清组次之。各组与正常对照组比较,均有显著差异(P<0.01)。阳痫中药对照血清组与阳痫中药血清组比较亦有显著差异(P<0.01)。与正常对照组比较,除G1u损伤模型组外,各组细胞内游离Ca2+浓度均下降,痰热型大鼠血清组最低,阳痫中药血清组次之,阳痫中药对照血清组再次之。除阳痫中药对照血清组外,痰热型大鼠血清组、阳痫中药血清组与正常对照组比较均有统计学意义(P<0.05)。阳痫中药对照血清组与阳痫中药血清组比较无统计学意义。结论：以“痰热”型体质大鼠制作的黄连解毒汤合定痫丸含药血清和减味五生饮合二陈汤含药血清均能提高Glu损伤PC12细胞活力,其中黄连解毒汤合定痫丸含药血清尚能减少Ca2+内流,提示上述方剂的含药血清均可能对Glu损伤PC12细胞有一定治疗,但黄连解毒汤合定痫丸含药血清与减味五生饮合二陈汤含药血清疗效高低尚需进一步研究。