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研究背景与目的缺血性脑卒中(Ischemic Stroke,IS)又名脑梗死,是指由于脑的供血动脉管腔狭窄或闭塞引起脑供血不足,导致局部脑组织缺血、缺氧性坏死,而出现相应神经功能障碍的一类疾病。IS的病理机制极其复杂,脑部缺血后神经细胞内会产生能量障碍、氧化应激、兴奋性毒性、酸中毒、炎性反应、钙稳态失衡、细胞凋亡等一系列级联损伤,最终导致中枢神经系统功能障碍。线粒体(Mitochondrion)是细胞进行氧化磷酸化、合成ATP的主要场所,是机体能量代谢的中心。IS发生时,线粒体平衡机制被打破,相关信号通路被激活,最终导致神经细胞级联性损伤及中枢神经系统功能异常。因此,以线粒体为切入点对IS进行探究,不仅可以从新的视角阐述IS的发病机制,也可为IS的未来治疗策略提供依据。线粒体是生成活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的主要场所,线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)没有组蛋白保护,缺乏抗氧化机制和有效修复系统,易遭受氧自由基的攻击,继而引起mtDNA突变和线粒体功能障碍。由于脑组织内不饱和脂肪酸含量丰富,抗氧化能力较弱,氧化应激损伤贯穿IS的整个病理进程。课题组前期选择ROS氧化产物及氧化应激相关代谢酶过氧化氢(H2O2)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)作为评估机体氧化应激水平的指标,已发现IS急性期存在显著的氧化应激反应,H2O2、CAT分别是IS发生的独立危险因素及保护因素。已有研究报道氧化应激可导致mtDNA拷贝数发生改变,进而影响线粒体的功能。mtDNA在线粒体基因组中的个数称为mtDNA拷贝数,每个线粒体约含有2-10个mtDNA拷贝数,正常人每个体细胞mtDNA拷贝数约为103-104,不同类型组织细胞中的mtDNA拷贝数存在特异性。目前,IS患者人群氧化应激与mtDNA拷贝数的关系鲜见报道。mtDNA 的 D 环区(Displacement loop region,D-loop)是人类线粒体基因组中唯一的非编码区,约有1122 bp,占全部mtDNA分子的6%,参与并调控着mtDNA的复制与转录。D环区富含A、T碱基,且是mtDNA与线粒体膜的结合位点,对氧化应激敏感,碱基替换比率比线粒体基因组其他区域高6-8倍,易引起基因突变,进而影响线粒体基因组复制和转录而导致mtDNA拷贝数发生改变。综上所述,本课题提出如下假说:氧化应激的激活及线粒体D环区的高突变将导致IS患者发生mtDNA拷贝数变异,并通过影响线粒体呼吸链的功能及稳定性参与IS的病理进程。因此,本研究分为三个部分:第一部分,首先在群体样本中,检测IS患者与正常对照mtDNA拷贝数,探究IS人群mtDNA拷贝数变异水平,并探讨IS患者mtDNA拷贝数与氧化应激和线粒体D环区突变的相关性;第二部分,模拟IS脑缺血/再灌注病理过程,构建氧糖剥夺/再灌注损伤(OGD/R)模型,在细胞模型中对群体结果进行验证,并寻找IS中调控mtDNA拷贝数变化的基因;第三部分,构建TFAM基因敲低-过表达细胞模型,通过检测线粒体呼吸链复合体酶活性、线粒体膜电位、ATP生成,探究mtDNA拷贝数变异对线粒体功能的影响。本研究从群体样本及体外细胞模型两个层面,深入探讨mtDNA拷贝数变异在IS发生、发展中的作用及其相关机制,为IS发生的病理机制和人群防治提供新的论据和新的思路。材料与方法第一部分缺血性脑卒中患者mtDNA拷贝数变异的研究1.研究对象:病例组选自2018年4月至2018年8月期间在河南中医药大学第一附属医院确诊的年龄≤65岁的IS患者101例;对照组选取同时期体检的性别、年龄与IS组相匹配的健康个体101例,排除有高血压、心血管病、糖尿病家族史者。本研究方案已经过郑州大学伦理委员会的审批,所有受试者均知情同意。2.提取受试者外周血DNA,实时荧光定量PCR相对定量法检测IS患者和正常对照mtDNA拷贝数水平。第二部分在氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)细胞模型中探究mtDNA拷贝数变异及其调控机制1.采用PC12细胞构建氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)模型,用CCK8检测不同OGD/R处理时间点细胞活力水平,确定OGD/R造模时间。2.提取PC12细胞中总DNA,实时荧光定量PCR相对定量法检测OGD/R处理组和对照组细胞中mtDNA拷贝数水平。3.提取OGD/R处理组和对照组细胞中总蛋白,Western blot检测HSP60蛋白表达水平。4.提取OGD/R处理组和对照组细胞中总RNA,逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR相对定量法检测OGD/R处理组和对照组细胞中参与调控mtDNA复制和转录的基因TFAM,POLG,TWNK,PGC-1α mRNA的相对表达量。第三部分构建TFAM基因敲低-过表达细胞模型探究mtDNA拷贝数变异对线粒体功能的影响1.构建TFAM基因敲低-过表达质粒转染HEK 293T细胞,提取细胞中RNA和蛋白,实时荧光定量PCR和Western blot检测质粒构建效果和转染效率。2.使用线粒体呼吸链复合体活性检测试剂盒,检测不同转染组细胞内呼吸链复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅲ、Ⅳ的活性。3.使用线粒体膜电位检测试剂盒,检测不同转染组细胞内膜电位水平。4.使用ATP检测试剂盒,检测不同转染组细胞内ATP生成水平。研究结果第一部分缺血性脑卒中患者mtDNA拷贝数变异的研究1.IS病例组mtDNA拷贝数水平显著低于正常对照组(P<0.05)。性别分层结果显示,男性IS患者组mtDNA拷贝数显著低于正常对照组(P<0.05),女性IS患者组mtDNA拷贝数与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。年龄分层结果显示,>50岁组IS患者mtDNA拷贝数显著低于正常对照组(P<0.05),而在≤50岁组中IS组与对照组之间差异无统计学意义(P>0.05)。2.相关性分析结果显示H2O2、CAT、SOD、MDA氧化应激指标与mtDNA拷贝数均无相关性。3.线粒体基因组D环区m.T195C位点在IS组和对照组的突变比例存在显著差异(P<0.01)。存在D环区突变位点的IS患者的mtDNA拷贝数显著低于未存在D环区突变位点的IS患者(P<0.05)。单个位点统计结果显示,存在m.A16215G或m.C16355A位点突变的IS患者的mtDNA拷贝数分别显著低于未存在D环区突变的IS患者(P<0.05)。第二部分在氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)细胞模型中探究mtDNA拷贝数变异及其调控机制1.OGD/R处理不同时间点细胞活力检测结果显示,氧糖剥夺4h后细胞活力降低为60%,OGD4 h/R4h后细胞活力降至最低,OGD4h/R4h为氧糖剥夺/再灌注模型最佳造模时间。2.OGD/R处理组细胞中mtDNA拷贝数显著低于对照组(P<0.05),与群体研究中的结果一致。3.OGD/R处理组细胞内HSP60蛋白表达量与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。4.OGD/R处理组细胞中TFAM基因mRNA相对表达量显著低于对照组(P<0.05),POLG、TWNK、PGC-1α基因mRNA相对表达量在两组间差异无统计学意义(P>0.05),TFAM可能是调控OGD/R细胞模型mtDNA拷贝数变异的基因。第三部分构建TFAM基因敲低-过表达细胞模型探究mtDNA拷贝数变异对线粒体功能的影响1.TFAM基因敲低型和过表达型质粒转染HEK 293T细胞后,TFAM基因和蛋白表达量在不同组内呈现出显著的降低或升高(P<0.05),mtDNA拷贝数变异细胞模型构建成功。2.转染敲低型TFAM质粒(sh-TFAM)细胞内,线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ活性显著下降(P<0.05);转染过表达型TFAM质粒(OE-TFAM)后,呼吸链复合体Ⅰ、Ⅱ活性升高(P<0.05)。3.与对照组相比,转染sh-TFAM组,线粒体膜电位显著降低(P<0.05),转染OE-TFAM组线粒体膜电位显著上升(P<0.05)。4.与对照组相比,转染sh-TFAM组ATP生成水平显著降低(P<0.05);转染OE-TFAM组ATP生成水平显著升高(P<0.01)。结论1.IS患者存在mtDNA拷贝数变异,线粒体基因组D环区m.A16215G与m.C16355A位点突变可引起IS患者mtDNA拷贝数降低。2.OGD/R细胞模型中TFAM基因表达下调与mtDNA拷贝数变异相关。3.TFAM基因调控mtDNA拷贝数变异,进而影响线粒体呼吸链复合体的活性、膜电位水平及ATP生成,最终导致线粒体功能障碍,参与IS的病理损伤。