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目的:本课题组前期研究发现雷公藤内酯醇(TP)与DDP联合应用可促进人卵巢癌细胞凋亡,产生协同抗癌作用。TP属于试验用品尚未应用于临床,是雷公藤多苷(Tripterygium wilfordii Hook.f.,GTW)的主要活性成份。雷公藤多苷具有抗炎、免疫抑制的作用,是否具有和TP类似的抗肿瘤作用呢?本研究在前期研究基础上,探讨GTW对SKOV3/DDP细胞凋亡和细胞周期的影响及其机制,从而为GTW应用于晚期耐药性卵巢癌提供实验室依据。方法:(1)取对数生长期细胞,随机分为以下八组:j组RPMI 1640、k组10μg/ml DDP、l组50μg/ml GTW、m组800μg/ml GTW、n组3200μg/ml GTW、o组10μg/ml DDP+50μg/ml GTW、p组10μg/ml DDP+800μg/ml GTW、q组10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW,药物作用24h后,于倒置相差显微镜及荧光倒置显微镜下观察细胞形态学变化。(2)取对数生长期细胞,随机分为以上八组,药物作用24h后,采用Hochest33258染色法计算细胞平均凋亡率。(3)取对数生长期细胞,随机分为以上八组,药物作用24h后,流式细胞术检测细胞周期变化。(4)取对数生长期细胞,随机分为以上八组,药物作用24h后,Western blot技术检测分析其PI3K/AKT/NF-kB信号通路相关因子PI3K、T-AKT、p-AKT(ser473)、Ik Bα、NF-kB、Bcl-2的表达变化。结果:(1)药物作用24h,与空白对照组及DDP组相比,GTW组、联合组均可见细胞发生凋亡样改变:细胞皱缩、伪足消失、细胞由短梭形变为圆形、细胞核染色质浓缩,并可见坏死细胞脱落漂浮于培养基上;DDP组与空白对照组相较无明显差异;GTW组及联合组与空白对照组相比,细胞发生凋亡样改变比例增加,且药物浓度越高,比例越大;联合组细胞凋亡比例均高于相应GTW组。(2)药物作用24h后,荧光倒置显微镜下观察发现:空白对照组细胞及DDP组细胞状态良好,伪足清晰,淡染、偶可见少量致密浓染细胞;GTW组、联合组细胞变小、细胞核内染色质高度浓缩、凝集、可见细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;GTW组及联合组与空白对照组相比较,浓染细胞明显增多,且随药物浓度升高而增加;联合组浓染细胞均多于相应GTW组。(3)10μg/ml DDP组凋亡率(3.33±0.61)及50μg/ml GTW组凋亡率(4.27±0.66)与空白对照组细胞凋亡率(2.20±0.20)相比无显著差异(p>0.05),800μg/ml GTW组凋亡率(9.67±0.70)及3200μg/ml GTW组凋亡率(17.60±1.20)与与空白对照组凋亡率相比,凋亡率显著升高(p<0.001),GTW组凋亡率呈浓度依赖性(p<0.05);10μg/ml DDP+50μg/ml GTW组凋亡率(18.27±1.01)、10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组凋亡率(24.20±0.80)及10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组凋亡率(38.33±0.50)与空白对照组凋亡率相比较,凋亡率显著升高(p<0.001),联合组凋亡率均呈浓度依赖性;联合组与相应GTW组相比凋亡率显著升高(p<0.001)。(4)GTW组、联合组耐药性卵巢癌细胞SKOV3/DDP均发生细胞周期S期阻滞。10μg/ml DDP组S期细胞比例(24.24±2.40)与空白对照组(19.34±2.83)相比无明显差异(p>0.05),50μg/ml GTW组S期细胞比例(37.23±0.97)、800μg/ml GTW组(38.86±1.71)、3200μg/ml GTW组(43.40±2.09)、10μg/ml DDP+50μg/ml GTW组(51.51+0.82)、10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组(53.10+0.48)及10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组(59.52+2.34)与空白对照组相比均明显升高(p<0.001);联合组S期细胞比例与相应GTW组相比均明显升高(p<0.001);各组S期细胞比例升高程度呈药物浓度依赖性(p<0.05)。(5)各组细胞PI3K、T-AKT、Ik Bα蛋白表达一致,无明显差异;p-AKT(ser473)、NF-kB、Bcl-2蛋白的表达随GTW浓度升高,总体呈下降趋势(p<0.05),GTW与DDP联合组表达量显著低于相应GTW单药组(p<0.05)。其中p-AKT(ser473)蛋白在800μg/ml GTW组、3200μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+50μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组相对表达量均较空白对照组降低(p<0.05),联合组蛋白相对表达量与相应GTW单药组相比较均明显降低(p<0.01);NF-kB蛋白在800μg/ml GTW组、3200μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+50μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组相对表达量均较空白对照组降低(p<0.05),其中联合组蛋白相对表达量与相应GTW组相比较均降低(p<0.05);Bcl-2蛋白在10μg/ml DDP组、10μg/ml DDP+50μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组、10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组相对表达量较空白对照组降低(p<0.05),其中800μg/ml GTW组与10μg/ml DDP+800μg/ml GTW组、3200μg/ml GTW组与10μg/ml DDP+3200μg/ml GTW组相对表达量相比较,相对表达量显著降低(P<0.01)。结论:1、GTW可抑制人耐药性卵巢癌SKOV3/DDP细胞生长,诱导细胞凋亡,且诱凋亡作用呈浓度依赖性。2、GTW可协同DDP诱导人耐药性卵巢癌SKOV3/DDP细胞凋亡,增加SKOV3/DDP的顺铂敏感性,且增敏作用呈浓度依赖性。3、GTW诱导细胞凋亡机制可能是通过阻滞人耐药性卵巢癌SKOV3/DDP细胞周期于S期,阻滞细胞生长,从而诱导细胞凋亡。4、GTW诱导细胞凋亡另一机制可能与抑制PI3K/AKT/NF-kB信号通路,下调p-AKT、NF-kB、BCL-2表达有关。