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本课题选取核黄素合成基础菌株为研究对象,通过比较基因组与比较转录组分析,筛选出潜在正向突变,进一步利用无痕等位基因置换技术,逆向代谢工程重构突变菌株,考察不同突变对于核黄素合成贡献度。对鉴定的正向突变进行机理分析,阐述导致枯草芽孢杆菌过量合成核黄素的遗传机制。转录组数据表明,和对照菌株相比,B.subtilis 24/pMX45菌株共有945个差异表达基因,表达水平上调的基因有483个,表达水平下调的基因有462个。进一步数据分析发现,B.subtilis 24/pMX45核黄素合成途径表达水平较高,但嘌呤代谢途径、一碳单位代谢相关途径表达水平低。同时,中心碳代谢途径和葡萄糖转运系统基因表达水平较低,这些可能是该菌葡萄糖利用速率低、生长速度慢和核黄素合成速率较低的原因。结合全基因组突变分析与比较转录组结果,通过无痕等位基因置换技术,鉴定出7个正向突变:RibC(G199D)、ribD+(G+39A)、PurA(P242L)、Ccp N(A44S)、YvrH(R222Q)、YhcF(R90*)、YwaA(Q68*)。将正向突变以及游离质粒pMX45重构至工程菌株BSW54/pMX45,可达到B.subtilis 24/pMX45菌株80%的核黄素合成水平。其中,RibC(G199D)、ribD+(G+39A)显著解调了核黄素操纵子的表达。PurA(P242L)导致了腺苷琥珀酸合成酶活性丧失,导致IMP向AMP合成受阻,菌体过量合成GMP/GDP/GTP,提高了核黄素合成前体物的供给水平。CcpN(A44S)丧失部分抑制活性,解调了糖异生代谢途径,提升了戊糖磷酸途径的通量和前体物核酮糖-5-磷酸的供给。双组分系统转录调节子基因YvrH(R222Q)突变显著提升核黄素合成能力。RT-PCR实验表明,受其负调控lytABC的表达水平明显上调,说明Yvr H(R222Q)部分丢失功能。转录组数据表明,LytC(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)过表达导致菌株嘌呤合成途径显著增强,提高了核黄素合成能力,推测Lyt C的过表达改变了细胞壁完整性和渗透性,并进一步解调了嘌呤合成途径。在谷氨酸棒杆菌工程菌株△4-PPC中过表达N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase可显著提高5-氨基乙酰丙酸合成能力,说明这种作用机制对于提高生物基产品的产量可能具有一定普遍适用性。