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研究目的:研究树突状细胞获得耐受性,成为耐受性树突状细胞的机制;研究耐受性树突状细胞在诱导移植免疫耐受中的作用及临床意义研究方法:(1)通过体外实验研究多种免疫调节因子使树突状细胞(DCs)获得耐受性,诱导其成为耐受性树突状细胞的机制。通过逆转录病毒转染Foxp3基因,在幼稚CD4+CD25-T细胞内强制性表达FOXP3蛋白,以获得CD4+ Foxp3+T细胞模型。通过流式细胞术研究转染后的CD4+ Foxp3+T细胞对树突状细胞的免疫共刺激分子影响。通过混合淋巴细胞培养了解树突状细胞的免疫功能改变。(2)构建人HLA-G1真核表达载体转染K562细胞并与DCs共培养后,流式细胞术检测DCs表面CD80,CD86,ILT3和ILT4分子表达情况,采用氚胸腺嘧啶核苷掺入法检测DCs对T细胞免疫功能的影响。(3)构建了包含人ILT4基因启动子的荧光素酶表达载体pGL3-ILTP并转染THP-1细胞,以研究IL-10作用下THP-1细胞表面免疫抑制性受体ILT4的表达变化及其所涉及的基因转录启动子区的调节机制。(4)肾移植术前采集供者来源PBMC在体外细胞因子诱导培养下成为供者来源DCs,与肾移植手术受者PBMC中分离出来的CD8+T细胞共培养,考察供者来源DCs与受者来源CD8+ T细胞的相互作用研究结果:(1)逆转录病毒转染Foxp3基因转染幼稚CD4+CD25-T细胞,成功建立了表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞模型。强制性表达Foxp3的CD4+CD25-T细胞可以在体外发挥免疫抑制作用,诱导DCs表面CD80和CD86表达水平下调。体外淋巴细胞增殖试验显示Foxp3转染小鼠CD4+CD25-T细胞可以抑制DCs对异基因淋巴细胞的活化。实验证实转染Foxp3的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞发挥作用依赖于细胞之间的直接接触。(2)膜表达的HLA-G1分子与DCs作用后,DCs表面免疫共刺激分子CD80,CD86表达下调,而抑制性分子ILT3,ILT4表达上调。HLA-G1作用后DCs作为异基因抗原刺激淋巴细胞增殖的活性明显下降。(3)成功构建了包含人ILT4基因启动子的荧光素酶表达表达载体pGL3-ILTP,通过流式细胞术以及半定量RT-PCR方法揭示,IL-10对单核来源THP-1细胞的抑制性受体ILT4表达存在促进作用,这在蛋白质水平和转录水平都得到了证实。通过双荧光素酶报告基因检测系统检测结果显示IL-10有增强ILT4启动子活性的作用。(4)处于移植耐受状态的肾移植患者外周血分离得到的CD8+T细胞其Foxp3的mRNA水平较其移植手术前的水平明显升高。将处于移植耐受状态的肾移植患者外周血分离得到的CD8+T细胞与其对应的供者来源的DCs共培养后,供者来源的DCs的ILT3和ILT4表达增强,呈现耐受DCs表型。研究结论:(1)Foxp3转染小鼠多克隆CD4+CD25-T细胞在体外诱导耐受性树突状细胞产生,耐受性DCs出现特征性表型,其抑制功能与诱导T细胞免疫不应答有关。(2)HLA-G1分子可以在体外条件下,下调DCs表面免疫共刺激分子水平,促进ILT3、ILT4表达,诱导免疫耐受性树突状细胞产生。(3)IL-10可以通过影响人类单核细胞白血病细胞系表达的免疫抑制性受体ILT4的启动子区活性来诱导耐受性DCs产生。(4)肾移植术后免疫耐受状态稳定的患者外周血存在CD8+Foxp3+T细胞亚群,可以诱导耐受性DCs产生,CD8+Foxp3+T细胞对耐受性DCs的诱导作用有抗原特异性。