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第一部分沙利度胺对系统性硬化病模型小鼠炎症及纤维化病理改变的影响目的:研究沙利度胺(Thal)对系统性硬化病(SSc)模型小鼠皮肤及肺组织炎症和纤维化等病理改变的影响。方法:将80只雌性BALB/c小鼠随机分为14天组和28天组(n=40),采用博来霉素(BLM)皮下注射方法诱导SSc小鼠模型,分别以10、20、30mg/kg/d剂量的Thal灌胃治疗,各组小鼠在灌胃第14、28天进行取材检测。HE和Masson’s染色观察小鼠背部注射部位皮肤、肺炎症和纤维化评分,并测定羟脯氨酸(HYP)的含量;Rt-PCR法及免疫组化法检测皮肤、肺组织I型胶原的表达情况。结果:(1)14天组和28天组Thal均能不同程度降低SSc小鼠模型皮肤、肺组织的炎症评分,其中14天组皮肤F值=23.867,P<0.05、肺组织F值=47.811,P<0.05,28天组皮肤F值=34.412,P<0.05、肺组织F值=45.953,P<0.05;(2)14天组和28天组Thal均能不同程度降低SSc小鼠模型皮肤、肺组织的纤维化程度,其中14天组皮肤F值=37.698,P<0.05、肺组织F值=65.500,28天组皮肤F值=72.906,P<0.05、肺组织F值=35.498,P<0.5;(3)14天组和28天组Thal均能不同程度降低SSc小鼠模型皮肤、肺组织的羟脯氨酸含量,其中14天组皮肤F值=5.834,肺组织F值=3.986,P<0.05P<0.05,28天组皮肤F值=3.631,P=0.045,肺组织F值=6.631,P=0.007;(4)14天组和28天组组间比较发现皮肤厚度、炎症评分在10mg/Kg/d Thal灌胃治疗时有统计学意义(P=0.039),而肺纤维化程度、炎症评分差异仅在30mg/Kg/d Thal灌胃治疗时有统计学意义(P=0.022);(5)28天组Thal能够以剂量依赖性的方式降低肺组织I型胶原m RN A的表达,而Thal 20、30(mg/kg/d)治疗时能够降低皮肤I型胶原m RN A表达(P<0.01);(6)28天组Thal能够以剂量依赖性的方式降低皮肤和肺组织I型胶原蛋白的表达,但在Thal20、30(mg/kg/d)治疗剂量下下调作用更强(P<0.05)。结论:Thal治疗能够有效减轻SSc小鼠模型皮肤和肺组织炎症、纤维化病变,并能够降低皮肤和肺组织中羟脯氨酸的含量,抑制皮肤和肺组织I型胶原的表达。因此,我们推测Thal可能是治疗SSc患者的一种经济、安全有效的药物。第二部分沙利度胺对系统性硬化病模型小鼠CD4+Th细胞以及TGF-β1/Smad3通路的影响目的:观察不同剂量沙利度胺(Thal)治疗前后对系统性硬化病(SSc)小鼠模型Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞以及相关因子水平和TGF-β1/Smad3通路的影响。方法:将80只雌性BALB/c小鼠随机分为14天组和28天组(n=40),采用博来霉素(BLM)皮下注射方法诱导SSc小鼠模型,分别以10、20、30mg/kg/d剂量的Thal灌胃治疗,各组小鼠在灌胃第14、28天进行取材检测。流式细胞术检测小鼠脾组织CD4+IL-4+(Th1)细胞、CD4+IFN-γ+(Th2)细胞、CD4+IL-17+(Th17)细胞以及CD4+CD25+Foxp3+(Treg)细胞的比例;RT-PCR、免疫组化、酶联免疫吸附试验等方法检测外周血、皮肤、肺组织中白介素(IL-)17A、转化生长因子(TGF)-β1、叉头状转录因子(Foxp3)、磷酸化细胞信号转导因子3(p-Smad3)表达情况,进而评估SSc模型小鼠炎症、纤维化病变的发生机制;蛋白免疫印迹方法检测TGF-β1/Smad3信号通路蛋白表达及磷酸化水平,并分析与Th17、Treg及其相关细胞因子的相关性。结果:(1)14天组和28天组中Thal均能下调脾脏Th17细胞,上调Treg细胞(均P<0.05),其中28天组中Thal 30(mg/kg/d)剂量治疗下能够将Th17细胞比例降低到NC组水平;(2)14天组和28天组中Thal均能以剂量依赖性的方式下调皮肤和肺组织细胞因子IL-17Am RNA的表达(均P<0.05),上调转录因子Foxp3m RNA的表达(均P<0.05);(3)14天和28天组组间对比发现皮肤、肺Foxp3 m RNA表达量、皮肤IL-17A m RNA表达量在30mg/Kg/d Thal灌胃治疗时有统计学意义(P=0.035,P=0.009,P=0.022),而肺IL-17A m RNA表达量在20mg/Kg/d Thal灌胃治疗时有统计学意义(P=0.005);(4)Thal以剂量依赖性的方式上调CD4+IL-4+(Th1)细胞以及细胞因子IFN-γm RNA细胞的表达(均P<0.05),下调CD4+IFN-γ(Th2)细胞的表达(P<0.05);(5)Thal以剂量依赖性的方式降低皮肤和肺组织IL-23R m RNA和RORgt m RNA的表达,相关性分析发现皮肤中IL-23R m RNA和RORgt m RNA以及肺RORgt m RNA水平与Th17呈正相关(r=0.9502,0.5664和0.7564,P<0.05);(6)Thal能够抑制TGF-β1/Smad3通路中TGF-β1、p-Smad3蛋白及TGF-β1 m RNA、p-Smad3 m RNA的表达(均P<0.05);(7)相关性分析表明TGF-β1 m RNA与皮肤和肺组织IL-17A m RNA及IL-17A蛋白的表达呈正相关(r值分别为0.7280、0.6408,均P<0.01),而与肺组织Foxp3 m RNA呈负相关(r=-0.3110,P=0.014);皮肤、肺组织以及血清中TGF-β1蛋白表达水平与IL-17A蛋白表达水平呈正相关(r值分别为0.8153、0.7187,均P<0.01);血清中TGF-β1含量与脾脏中Th17/Treg呈正相关(r=0.6366,P=0.0107);结论:(1)Thal能够下调Th17细胞比例及细胞因子IL-17A的表达,上调Treg细胞比例及其转录因子Foxp3的表达,降低Th17/Treg比值;(2)Thal处理可上调Foxp3的表达,促进其与RORgt的结合,从而抑制Th17细胞的增殖和功能;(3)Thal处理可以增加Th1细胞及细胞因子IFN-γ水平,但减少Th2细胞水平;(4)Thal治疗可以抑制TGF-β1/Smad3信号通路的激活,从而预防纤维化病变。