研究背景骨是一种有机-无机复合,具有三维多孔结构的功能性复合物,是人体的重要组成部分。骨组织是一种结缔组织,该组织具有致密而坚硬的特点,由细胞,纤维和基质组成,具有多种形态以及复杂的内部和外部结构。对于人体来说,骨骼起着支撑和保护内脏的重要作用,同时骨骼在运动中起杠杆作用及造血功能等作用。虽然骨具有自我修复的能力,但是由创伤,骨骼疾病或骨肿瘤切除等原因造成的骨组织较大缺损却没法通过骨自我修复来达到愈合的效果,因而骨缺损成了临床上的常见疾病之一。据资料统计,我国每年因创伤、骨骼疾病、肿瘤切除等疾病造成的骨缺损病人高达100万以上,大范围、大面积的骨缺损修复仍是临床上的难题之一。由外伤、骨骼疾病或肿瘤切除引起的骨损伤和骨缺损,不但会带来疼痛,使日常活动严重功能受限,导致致畸形,甚至致死可能。虽然骨具有自我修复的能力,然而大面积的骨缺损很难通过骨再生和自我修复实现。目前,临床上用于骨缺损修复的移植材料包括自体骨、异体骨和异种骨。各种材料的特性不一,各有其优缺点。自体骨都具有良好的骨诱导能力、成骨能力和骨传导作用,而且也是骨移植的“金标准”。但自体骨来源有限,且会对供体部位造成新的缺损,如感染、骨折等,限制了其应用。同种异体骨虽然来源比自体骨丰富,但容易发生排斥反应,而且有传播疾病的风险；另外,异体骨诱导成骨的能力也不如自体骨。异种骨虽然具有来源丰富,易于获得和加工储存的优点,但是由于存在免疫排斥反应的风险,异种骨在应用上也受到较大限制。为了降低移植后的免疫排斥反应,可以通过对异种骨进行适当的处理。例如,将尸体进行冷冻保存,随后获得的同种移植物,并用甘油化方法可保持软骨细胞的活力,便可降低骨的免疫原性(在移植时已是死骨)。移植后,病人不需要采用免疫抑制剂,虽然这些病人可产生抗HLA抗体,但是早期的随访结果显示无软骨损坏。需要引起注意的是,异体移植会带来病原体传播,传染,甚至移植失败。因此,人们一直在寻求一种优良的治疗骨缺损的修复方法。近年来,随着经济和科技的发展,组织工程和再生医学的发展和水平得到了大幅度的提升,从而为骨缺损的修复提供了新的选择。骨组织工程支架作为组织工程非常重要的要素之一,其制备方法和作用引起了人们的广泛关注。骨组织工程支架是骨再生的一种替代治疗策略。生物材料支架可以通过指导细胞行为及功能来促进组织再,在再生医学和组织工程方面发挥着主要作用。将骨组织工程技术应用于大面积的骨缺损治疗,可以克服自体骨移植和异体骨移植的缺点。因此,在骨组织工程方面,理想骨修复支架的要求应该包括以下几个特点：好的骨传导性和骨诱导性、矿化作用、合适的机械性能、高孔隙率、相互连通的结构以及由生物相容性和生物降解性好的生物材料构成。在过去的一个世纪,各种生物材料已经在骨缺损和骨折的治疗中使用,例如金属、陶瓷、高分子聚合物等人工骨材料。由于自体骨的稀缺和异体骨存在排斥及传播疾病等缺点,这些不同种类的人工骨材料作为骨缺损的替代材料,在骨缺损的治疗中,发挥着越来越重要的替代作用。金属,陶瓷和聚合物在骨支架的开发中,由于各自的性能不一,对骨支架都赋予不同的优点,例如,对于高分子聚合物,特别是天然高分子来说,良好的生物相容性和可降解性是非常理想的属性。另外,生长因子,干细胞也是骨修复材料的要素之一,将生长因子、干细胞、支架复合,形成复合支架,是现在骨修复材料的研究热点。但是生长因子活性容易失活而且价格昂贵,而且在负载生长因子的加工和制备过程中,往往由于有机溶剂,化学试剂和注射压力的影响,其稳定性和活性会因此而降低。另外,由于干细胞的定向分化存在不确定性。另外,该类支架的成本偏高,技术难度大,这些都限制此类复合支架发展。因此,设计一种非生长因子和干细胞的生物仿生骨组织工程支架用于修复骨缺损是很有必要的。骨的主要无机成分为羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA),在众多生物材料中,由于纳米HA的形貌,成分,晶型和结晶度与天然骨中的骨矿物非常相似,因此其具有好的骨诱导性、骨传导性和骨整合性,成为大块骨缺陷再生方面的研究热点。此外,当HA与其他材料复合,例如天然高分子,制备成复合支架时,HA能够通过增加支架的表面特性及其粗糙度,从而促进骨细胞的活力和其增殖,有利于骨缺损部位的修复。另外,纳米材料是21世纪的研究热点,将现有的物质制备成纳米粒子,物质就会显示出不一样的性质,能够赋予材料新的性能。纳米级的骨组织修复材料具有自固化成型、机械强度高等特点,无毒无污染,优异的降解性能。纳米羟基磷灰石具有良好的生物相容性,能够诱导骨组织的生长发育,与骨组织细胞能够形成牢固的结构。但是羟基磷灰石的韧性不强,力学性能差,降解性能差。因此,将HA粒子与天然高分子复合制备成骨组织工程支架,能够结合天然高分子与HA粒子的优点,弥补双方的不足。纳米微晶纤维素(cellulose nanocrystals, CNC),是纤维素的衍生物,一般是通过浓硫酸水解纤维素的方法而制得,其中纤维素是自然界最普遍,最丰富的生物聚合物。纳米微晶纤维素,由于其纳米级尺寸(在至少一个维度),也常常被称为晶须,纳米晶须,纳米颗粒,纳米纤维,微晶或微晶粒。一般来说纳米微晶纤维素的宽度为2-50nm,长度为100-2000nm,具有较大的比表面积、高强度,低密度、在溶液中良好的分散性、天然无毒性、可降解,良好生物和细胞相容性等特点,同时可以被用作脱钙骨基质的载体,并在体内实验中取得良好结果。然而,粉末状的HA和CNC的低抗压强度限制了它们在非或低承重骨修复上的应用。为了提高HA和CNC的抗压强度,在制造功能支架时使HA和CNC纳米粒子在聚合物基质中均匀分布是传统的方法。陈等人制备了生物活性玻璃／壳聚糖/CMC复合材料水凝胶用于骨再生。结果表明,复合水凝胶有止血效果,并且它的生物降解性可引导骨缺陷的功能性重建。丝素蛋白(silk fibroin, SF),从蚕茧中提取的一种天然高分子,拥有极好的机械强度,生物相容性,长期生物降解性以及易加工性,而且成本低廉,来源丰富。丝素蛋白是具有p片层构象的线性多肽,由于其低免疫原性、良好的生物性功能和易加工性,经常在组织工程中使用。最近有研究表明,丝素蛋白中的纳米尺寸的蛋白对生物矿化有调节作用,这是由于丝素蛋白结构中的双层片状结构存在排斥力。另外,随着丝素蛋白浓度的增加,会逐渐改变了纳米羟基磷灰石的形态。这特征使得丝素蛋白在骨缺损的修复材料中,能够充当生物矿化的模板。许多人研究了HA/SF支架用作骨缺损修复材料的可能性,结果表明HA/SF支架是一种促进骨再生的很好的材料。研究表明,具有纳米拓扑结构的人工骨支架在骨再生领域中具有巨大的潜力。另外,在之前的研究当中,纳米羟基磷灰石,纳米微晶纤维素、丝素蛋白其中一种或两种的复合材料已经广泛在骨再生领域中被研究或应用；但是将三种材料复合,制备成复合支架用于骨再生领域,还没有发现有学者进行相关的研究和报道。因此,在本研究中,我们的目的是设计一种新型的生物仿生支架用于颅骨的全层缺损修复,该支架主要采用纳米非金属材料(纳米羟基磷灰石),天然高分子(纳米微晶纤维素)和蚕茧的提取物(丝素蛋白),通过一系列的制备,复合办法,并且在不添加生长因子和干细胞的情况下,制备一种具有骨诱导、骨引导,纳米拓扑结构和可降解功能的生物仿生支架。第一部分纳米羟基磷灰石/纳米微晶纤维素/丝素蛋白复合支架的制备与表征实验目的：在不添加生长因子和干细胞的情况下,制备一种具有良好骨诱导和骨引导,并且可降解,生物相容性良好的骨修复组织工程支架。实验方法：首先采用水热法合成纳米羟基磷灰石,酸解法制备纳米微晶纤维素,通过蚕茧提取丝素蛋白,制备丝素蛋白溶液。随后通过物理共混和冷冻干燥的办法,制备复合支架,并对其进行一系列的表征。实验结果：在本研究中,我们首先通过水热合成法制备了针形结构的纳米羟基磷灰石颗粒,该颗粒呈针形结构,长度为100-300 nm,宽度为20-30 nm。其次,通过酸解法,利用纤维素制备了纳米微晶纤维素,该纳米微晶纤维素呈短棒状,长度约为150-350nm,宽度约为20-40nm,而且结构规整。随后,我们将纳米HA, CNC和SF溶液,经过简单的物理共混,将HA和CNC均匀分散在丝素蛋白溶液中,随后通过冷冻干燥的方法,制备了HA/CNC/SF多孔复合支架。该复合支架的微孔分布均匀,孔与孔之间的连通性好,而且孔径比较均一,平均孔径为110μm,孔隙率为90%左右,有利于成骨细胞的粘附,增殖和分化。另外,HA/CNC/SF支架具有良好的热稳定性和力学性能,压缩应力和压缩模量分别为200.7±15.3和617.5±25.2 KPa。另外,通过细胞相容性测试可以知道,四种SF支架都具有良好的细胞相容性,而HA/CNC/SF支架更加有利于成骨细胞的增殖。另一方面,在碱性磷酸酶(Alkaline phosphatise,ALP)的活性测试中,HA/CNC/SF支架上的小鼠原成骨细胞(MC3T3-E1)的碱性磷酸酶活性表达显著高于其他三种SF支架,证明了HA/CNC/SF支架能够更有效地促进原成骨细胞的体外成骨分化。实验结论：本研究制备的HA/CNC/SF支架具有良好的骨诱导和骨引导能力,而且细胞相容性良好,具有修复骨缺损的潜力。第二部分SF支架对大鼠颅骨全层缺损的修复虽然骨有自我修复的能力,但是当骨缺损的面积超过一定的尺寸,骨的自我修复能力就大大地受到了限制,甚至是没法自我修复。因此,对于大面积的骨缺损,需要植入骨修复材料,对大面积的缺损部位进行修复。标准化的动物模型有利于我们研究复合材料对骨缺陷修复的情况。根据文献的报道,对于大鼠来说,当其颅骨的骨缺损区的直径在超过5mm的时候,该缺陷是该物种在特定的骨头没法自我修复的。实验目的：检验我们制备的HA/CNC/SF复合支架对大鼠的颅骨全层缺损模型(直径为6mm)的骨缺损的修复效果。实验方法：在制造了大鼠的颅骨缺损后,将HA/CNC/SF复合支架移植到大鼠的颅骨缺损部位。为了对比,我们也分别将SF、CNC/SF、HA/CNC/SF支架移植到大鼠的颅骨缺损部位。在特定的时间点(移植术后4W、8W、12W),采用Micro-CT测定缺损区大体修复情况、骨密度情况和组织学染色研究缺损部位新骨形成的情况。实验结果：通过Micro-CT的3D重建效果图,可以很直观地看到,随着时间的增加,四种支架对缺损部位的修复情况不一,其中SF组的修复情况最差,经过12周的修复,全层缺损的颅骨部位依旧残留很大的缺损部位没有被修复好,而其它三个组别,缺损部位的面积均较前有较明显的减小,其中HA/CNC/SF组的修复情况最理想,缺损部位被大量新生骨填充,几乎完全修复,而HA//SF组及CNC/SF缺损面积也较小,缺损处新生骨组织填充较多。另外,通过BMD数值分析可以得知,随着时间的增加,四个实验组的骨密度有所增加,其中HA/CNC/SF组的骨密度值最大,而且与正常骨的骨密度接近。另一方面,通过组织学的HE和番红固绿分析得知,在植入期间,HA/CNC/SF支架不会引起缺损部位炎症反应,具有良好的生物相容性,而且新生的骨组织已经长入支架孔内,这说明HA/CNC/SF具有良好的骨诱导和骨引导作用。此外,相对于其他三种SF支架,HA/CNC/SF支架的骨修复效果最好,术后12周,缺损部位基本完全修复,而且新生骨的形态与原始骨相似。同时,随着时间的增加,支架的降解越来越明显,术后12周,只有很少量的支架存在,新生的骨与周边骨组织结合紧密。实验结论：结果表明本实验制备的HA/CNC/SF复合支架具有可降解性和骨诱导再生能力,生物相容性良好,而且其降解速率与骨缺损部分的再生速率相匹配。通过上述两部分的研究与实验,我们可以得出本实验的结论,在骨修复组织工程中,HA/CNC/SF可以作为很有潜力的一种骨缺损修复材料将来可以应用于临床治疗骨缺损。