烟草野火病菌EZ∷Tn5突变体的构建、筛选和突变基因的克隆

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构建植物病原细菌的突变体库是其功能基因组学研究不可缺少的重要组成部分,是阐明重要基因功能的重要基础和前提。烟草野火病是由丁香假单胞菌烟草致病变种(Pseudomonas syringae pv. tabaci)引起的一种重要细菌性病害,野火病菌作为植物病原丁香假单胞种团(P. syringae groups)里50多个致病变种中的一个代表,其基因组学、分子病理学研究明显落后于番茄致病变种、丁香致病变种、菜豆致病变种等。为了挖掘野火病菌的致病相关基因,本研究以烟草野火病菌为材料,采用转座子介导的突变体策略,将<R6Kγori/KAN-2>Tnp TransposomeTM携带的EZ::Tn5及kanr基因,通过电转化法插入至烟草野火病菌的基因组DNA中,构建野火病菌的EZ::Tn5随机插入突变体库,并从中筛选致病性、运动性和产胞外蛋白酶能力变异的突变株。然后通过TAIL-PCR技术扩增EZ::Tn5插入位点的侧翼序列,为进一步研究和分析插入位点基因奠定基础,同时也为病菌-寄主的分子互作研究提供有效的材料。主要研究结果如下:1.利用EZ::Tn5转座系统,通过电转化法分别成功构建了烟草野火病菌产野火毒素菌株WT4和不产毒菌株SMX006的EZ::Tn5插入突变体库。在转化电压为2400V条件下,烟草野火病菌产毒菌株WT4和不产毒菌株SMX006的转化效率分别为4.2×103,0.8×103 cfu﹒μg-1 DNA;在转化电压为1800V时,烟草野火病菌产毒菌株WT4的转化效率降低至1.64×103 cfu﹒μg-1 DNA。通过对突变体进行特异性的PCR鉴定、Kan抗性筛选以及连续继代培养,结果表明EZ::Tn5均稳定地插入到了烟草野火病菌基因组DNA中。2.以烟草野火病菌不产毒菌株SMX006的EZ::Tn5突变株为材料,对其进行了致病性、运动性和胞外蛋白酶活性测定,获得了2个致病力明显减弱的突变株(H028、H029)、1个运动能力明显减弱的突变株(H028)、1个运动能力丧失的突变株(H029)、2个产胞外蛋白酶能力明显减弱的突变株(H046、H047)以及1个胞外蛋白酶缺失的突变株(H045)。3.为了分析突变株的EZ::Tn5插入拷贝数,首先根据EZ::Tn5特异性序列设计PCR引物,并进行PCR、切胶回收、地高辛标记,获得了地高辛标记的DNA探针。选取烟草野火病菌不产毒菌株SMX006突变体表型发生变化(H028、H029、H045、H046)和表型没有发生明显变化的突变株(H025、H031、H048、H071),分别提取其基因组DNA,并进行HindⅢ限制性内切酶消化。Southern杂交结果表明所有供试的8个EZ::Tn5突变株DNA中EZ::Tn5转座子均为单位点插入。4.通过TAIL-PCR方法,扩增到了8个突变株的EZ::Tn5插入位点侧翼序列并进行了测序,通过Blast比对,发现7个突变体基因组中EZ::Tn5的插入位点均位于23SrRNA或16SrRNA基因上,而且插入方向都是顺向。仅有1个突变体的EZ::Tn5插入位点不在rRNA基因上。
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