【摘 要】
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目的探究氧化应激在镉诱导小鼠睾丸间质TM3细胞自噬和凋亡中的作用以及自噬对镉诱导TM3细胞凋亡的影响。方法CCK-8法检测CdCl2对TM3细胞活性的影响。采用0、5、10μM CdCl2处理TM3细胞,Mito Tracker RedCMXRos染色法观察TM3细胞线粒体形态;JC-1染色定量检测TM3细胞线粒体膜电位;DCFH-DA探针法检测TM3细胞内活性氧水平;m Cherry-EGFP-
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目的探究氧化应激在镉诱导小鼠睾丸间质TM3细胞自噬和凋亡中的作用以及自噬对镉诱导TM3细胞凋亡的影响。方法CCK-8法检测CdCl2对TM3细胞活性的影响。采用0、5、10μM CdCl2处理TM3细胞,Mito Tracker RedCMXRos染色法观察TM3细胞线粒体形态;JC-1染色定量检测TM3细胞线粒体膜电位;DCFH-DA探针法检测TM3细胞内活性氧水平;m Cherry-EGFP-LC3b质粒转染TM3细胞,荧光共聚焦显微镜检测CdCl2对TM3细胞自噬流的影响;Hoechst 33342染色法和流式细胞术检测TM3细胞凋亡;Western blot检测TM3细胞氧化应激相关蛋白HO-1、SOD2,自噬相关蛋白LC3、P62和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleavedCaspase-3的表达水平;在含/不含CdCl2（10μM）的细胞培养液中加入氧化应激抑制剂NAC（200μM）处理TM3细胞24h,Western blot检测细胞氧化应激、自噬和凋亡相关蛋白的表达水平。在含/不含CdCl2（10μM）的细胞培养液中分别加入自噬抑制剂3-MA（150μM）和氯喹（CQ,10n M）处理TM3细胞24h,检测细胞自噬与凋亡水平,分析CdCl2诱导TM3细胞自噬与细胞凋亡的关系。结果1、CdCl2可诱导TM3细胞氧化应激、自噬和凋亡与对照组相比,染毒组TM3细胞线粒体网状结构被破坏,线粒体形态由长管状变为点状,含点状线粒体的细胞比例逐渐升高,线粒体膜电位降低,细胞内活性氧水平升高和凋亡细胞比例升高。CdCl2阻碍自噬体与溶酶体的融合过程。Western blot结果显示,HO-1、LC3-II/LC3-I、P62及cleavedCaspase-3的蛋白表达显著增加,而SOD2和Bcl-2蛋白的表达降低,差异有统计学意义（P＜0.05）。2、CdCl2促进ROS产生引起TM3细胞自噬异常和凋亡用N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）抑制细胞氧化应激后,与镉染毒组相比较,（NAC+Cd）组中Hoechst 33342染色细胞核染色减弱、亮蓝色凋亡小体数量减少,Western blot结果显示HO-1、LC3-II/LC3-I、P62和cleavedCaspase-3蛋白表达量均降低,而SOD2、Bcl-2蛋白表达水平升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,提示抑制TM3细胞氧化应激后,CdCl2对细胞自噬和凋亡的诱导作用均明显减弱。3、CdCl2通过抑制自噬流诱导TM3细胞凋亡自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）和氯喹（CQ）处理细胞后,与Cd染毒组相比较,（3-MA+Cd）组Hoechst 33342染色细胞核染色减弱、亮蓝色凋亡小体数量减少,（CQ+Cd）组中细胞核染色加强、亮蓝色凋亡小体数量增多;Western blot结果显示（3-MA+Cd）组细胞Bcl-2蛋白水平升高而LC3-II/LC3-I、P62和cleavedCaspase-3蛋白水平降低,（Cd+CQ）组细胞中Bcl-2蛋白水平降低而LC3-II/LC3-I、P62和cleavedCaspase-3蛋白水平进一步升高,差异有统计学意义（P＜0.05）,提示3-MA通过抑制自噬体形成降低自噬水平从而缓解镉诱导的TM3细胞凋亡;CQ通过抑制自噬体与溶酶体的融合过程从而加剧镉诱导的TM3细胞凋亡。结论CdCl2通过激活氧化应激引起小鼠睾丸间质TM3细胞自噬异常和细胞凋亡,而自噬在CdCl2诱导的TM3细胞凋亡中起细胞毒性作用。
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