小麦抗叶锈基因Lr35相关基因组DNA片段的分离与鉴定

来源 :河北农业大学 | 被引量 : 4次 | 上传用户:chijr
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以抗病基因中的几个保守序列为依据合成寡核苷酸引物,并形成不同引物组合,通过对小麦抗叶锈近等基因系材料ThLr35及其感病亲本Thatcher基因组DNA进行扩增,同时结合ISSR标记,寻找预期的RGA片段,为克隆小麦抗叶锈基因Lr35目的基因奠定了基础。主要实验结果如下: 1.根据抗病基因NBS-LRR保守序列不同区域设计4个简并引物,形成不同组合。其中,引物组合RAF1:R2、RAF8:R2、RAF8:R5和组合RAF1:R5均能获得有效扩增,而且有一条约630bp条带几乎在各种引物组合中都存在。将根据保守序列GG(V/I)GKTT(P-loop)和GLPLAL(domain5)设计的引物组合RAF1:R2扩增获得的该DNA条带回收,并克隆,测序,BLASTn同源性比较表明,与GeneBank中一211Kb片段(AF326781)同源性达79%,而该211Kb片段为分离获得的450Kb小麦抗叶锈基因Lr10大片段的一部分。 2.根据蛋白激酶类保守序列DVKPEN(domainⅥ)和GTPWYIAPE(subdomainⅧ)设计一对简并引物RAF3:R4扩增,获得不同大小的4条片段,多次重复,表现良好的稳定性;而根据LRR类保守序列设计引物扩增,未获得有效扩增产物,说明小麦基因组中可能含有蛋白激酶类结构,而不含胞外LRR结构。 3.用小麦抗叶锈基因Lr35 ISSR标记回收片段作模板,以不同类保守序列引物进行扩增,NBS-LRR类引物组合RAF1:R2可获得一条597bp特异性条带,将其回收,克隆,测序。根据BLASTn同源性比较,与GeneBank中小麦属BAC克隆(AF459639)和一211Kb双倍体小麦(AF326781)同源性高达90%,可将该片段初步确定为Lr35相关片段。 4.根据RAF1:R2引物扩增产物的测序结果,设计两对特异性引物,摸索不同的PCR反应条件,在ThLr35基因组DNA中最终分别获得约1kb和2kb片段,而在感病亲本Thatcher中未获得相应扩增片段,可能为Lr35相关片段。
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