基于转录组和代谢组联合分析燕麦响应盐碱胁迫的机制研究

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土壤盐碱化是世界性的环境与生态问题,致使可利用的耕地面积缩减,对粮食安全产生了极大的威胁。深入解析植物耐盐碱机制、挖掘耐盐碱功能显著的关键基因,进行耐盐碱作物种质资源创新成为当今盐碱地利用的重要措施。燕麦是优良的粮饲兼用型作物,在世界广泛栽培,也被认为是盐碱地改良的替代作物之一。因此深入研究燕麦的抗盐碱机制,对于盐碱地资源开发与利用具有重大意义。本研究在对不同燕麦品种耐盐碱能力鉴定的基础之上,选择代表性抗敏品种进行盐碱胁迫处理,通过燕麦响应盐碱胁迫的生理生化指标以及转录组和代谢组差异分析,揭示燕麦耐盐碱机制。主要研究结果如下:1.燕麦耐盐碱种质资源筛选以源于7个不同地区的63个燕麦品种(系)为试验材料,在6个不同盐碱浓度胁迫下,进行燕麦萌发期耐盐碱能力筛选;利用Boltzmann曲线拟合,确定[Na+]150 mmol·L-1p H 9.8为鉴定燕麦耐盐碱能力的最适胁迫浓度。在最适盐碱浓度胁迫下,对发芽率、发芽势、发芽指数、芽长、根长、地上鲜重和单株鲜重等性状指标相对值进行聚类分析,将供试的63个品种分为4类。依据聚类结果及生产实践确立了白燕7号(BY)为耐盐碱品种、冀张燕4号(YZY)为盐碱敏感品种,并作为下一步研究的试验品种。2.盐碱胁迫对燕麦幼苗生长和生理生化指标的影响盐碱胁迫条件下,BY和YZY两个品种的株高、干重、光合色素含量均随着胁迫浓度的增加而下降,耐盐碱型品种BY受到的影响小于敏感型品种YZY;在燕麦根系中丙二醛(MDA)含量随着盐碱胁迫浓度增加而增加,YZY增加幅度高于BY。经过盐碱胁迫后,两个品种的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量总体表现为增加。甜菜碱的含量在BY中呈现显著增加趋势,而在YZY叶片中增加显著,在根系中变化则不显著。燕麦体内的抗氧化酶均表现为随盐碱浓度增加而升高或升高后再下降的趋势,且在BY中增加幅度高于YZY;其中过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)变化比较突出。盐碱胁迫下,燕麦通过对Na+的选择吸收或增加K+的吸收来维持自身的K+/Na+。BY根系中始终维持一个较好K+/Na+值;而YZY根系中,在中低盐碱胁迫下K+/Na+值较为稳定,在高浓度时K+/Na+值显著升高。两个燕麦品种叶片中K+/Na+值表现出低浓度下无变化而中高浓度下显著下降的相同规律。3.燕麦响应盐碱胁迫转录和代谢分析燕麦转录测序数据组装共获得44,591条Unigene,共有31,365条Unigene被注释。共有23,423条Unigene获得5709个GO条目注释;共有12085条unigene被KEGG注释。非盐碱胁迫情况下,YZY与BY相比较差异基因仅64条,其中上调39条、下调25条;经胁迫后差异基因为1,700条,其中上调923条,下调777条;说明燕麦响应盐碱胁迫后差异基因数量剧增。差异基因GO功能富集分析发现,YZY与BY在盐碱胁迫后,生物学过程中蛋白质磷酸化、次生代谢物的生物合成过程、类黄酮生物合成过程,分子功能中蛋白激酶活性、DNA结合、ATP结合、铁离子结合,细胞组分中质体、线粒体、质膜、细胞壁等节点差异基因数量增加十分突出。KEGG富集分析发现,两个燕麦经过盐碱胁迫处理后显著富集的代谢通路有7个,差异基因共计83条。其中分布在苯丙素生物合成通路中基因数量最多,其次是淀粉和蔗糖代谢通路、ABC转运蛋白、磷酸肌醇代谢、甘油磷脂代谢通路等。其中一些基因在GO和KOG注释中具有过氧化物酶活性、单加氧酶活性、次生代谢物生物合成运输和分解代谢作用等。所以这些通路中显著富集的基因可能是引起两个燕麦品种耐盐碱能力不同的原因。转录因子预测结果显示925条基因分属于64个转录因子家族。燕麦根系盐碱胁迫响应下,共有隶属于31个转录因子家族的78个转录因子基因差异表达,差异表达数量较多的转录因子家族分别是WRKY、b HLH、AP2/ERF-ERF、b ZIP;这些家族中大多数的转录因子参与了植物对盐胁迫的应答反应。基于广泛靶向代谢组技术的代谢分析,从12个燕麦样品中共检测到752个代谢物。Metabolic pathways和Biosynthesis of secondary metabolites通路中的差异代谢物数量最多。两个燕麦品种经过盐碱胁迫后有机酸类、氨基酸、黄酮类、糖类等物质均积累,但是积累程度存在差异。其中BY通过甜菜碱、脯氨酸和迷迭香酸响应盐碱胁迫表现最突出。而YZY则通过糖类、水杨酸、柠檬酸、顺乌头酸、异甘草素积累响应盐碱胁迫最突出。说明两个燕麦品种在代谢水平上对盐碱胁迫的响应是不完全相同的;这些代谢产物可作为燕麦耐盐碱特征代谢物。4.燕麦响应盐碱胁迫的组学联合分析及目的基因定量检测在BY中相关联的差异基因(DEGs)和差异代谢物(DAMs)为53和60个,YZY中相关联的差异基因和代谢物为20和22个。KEGG共富集分析发现6个代谢通路在两个燕麦品种中都显著富集,而且这些通路都与氨基酸的合成与代谢有关,反应了燕麦响应盐碱胁迫的共同特征。仅在BY中共富集的代谢通路共计27个,其中氨基酸代谢相关通路12个,其余代谢通路包括苯丙素的生物合成等。而仅在YZY中共富集的代谢通路与糖的代谢密切相关,反应了YZY品种响应盐碱胁迫的主要特点是与糖有关。这些代谢通路中的差异基因或代谢物可能是导致BY与YZY品种响应盐碱胁迫的差异的因素。根据转录测序和代谢组学分析,选择与燕麦盐碱胁迫生理生化响应相对应的32条基因进行荧光定量PCR(q RT-PCR)检测,检测结果与转录测序结果较一致。BY中显著上调的磷酸丙酮酸羧化酶、丙酮酸脱氢酶、ABC转运蛋白、磷酸乙醇胺N-甲基转移酶、△-1-吡咯啉-5-羧酸合酶、过氧化物酶、多胺氧化酶、β-葡萄糖苷酶、蔗糖合酶基因等,YZY中显著上调的过氧化物酶、β-葡萄糖苷酶和丙酮酸脱氢酶。与燕麦响应盐碱胁迫生理生化指标变化情况相一致,这些基因将是深入挖掘燕麦响应盐碱胁迫分子机理的主要候选基因。总体而言,燕麦可以通过渗透调节、过氧化调节作用来应答盐碱胁迫,耐胁迫能力品种间存在差异。盐碱胁迫诱导与生理代谢相关的基因表达产生差异,这些差异基因主要涉及蛋白质合成及其活化、光合成作用、呼吸作用及抗氧化调节等;相关的代谢物主要包括氨基酸和糖等物质。
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