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急性脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)分为原发性损伤和继发性损伤两个病理过程。继发性SCI机制主要有缺血再灌注损伤、自由基损伤与脂质过氧化、一氧化氮作用、免疫炎症反应、兴奋性氨基酸毒性作用等。其中,免疫炎症反应作为损伤早期的一个重要病理过程,参与了继发性SCI。
补体系统作为机体主要的免疫防御机制之一,在一定病理条件下会过度激活而导致组织细胞损伤。补体系统激活在许多中枢神经系统疾病的发生发展中起到重要的作用。因此深入地研究和了解补体系统有可能为众多疾病提供抗补体治疗的策略和方向。
近年来有研究表明,抑制补体激活可以减轻继发性SCI而起到神经保护作用。SCI的抗补体治疗正逐渐成为研究的热点和方向。而开发高效、安全、低成本的补体抑制剂已成为一种必要和需求。
许多传统中草药已经被证明具有显著的抗补体功效。草麻黄作为一种使用最为广泛的中草药之一,千百年来被应用于许多与免疫炎症反应相关的疾病的治疗中,疗效显著且副作用少。目前草麻黄补体抑制成分(anti-complement componentof Ephedra sinica,ES)已被高度提纯,在体内与体外实验中,被证明主要在补体C2和C9水平具有强力的补体抑制作用。
目的：
探讨草麻黄补体抑制成分ES对大鼠急性SCI后补体表达、免疫炎症反应及运动神经功能的影响,为SCI的抗补体治疗提供更多的理论依据。
方法：
一、草麻黄补体抑制成分的提纯及活性鉴定
应用多步沉淀及薄层层析方法进行草麻黄补体抑制成分的提纯并进行活性鉴定。
二、大鼠脊髓损伤模型的制备及分组
选用150只健康SD大鼠,应用NYU脊髓机械损伤模型制备装置,参照改良的Allens重物打击法制备大鼠SCI模型。大鼠被5％的异戊巴比妥钠(50mg/kg)腹腔注射麻醉后,行T10全椎板切除,显露硬脊膜,用质量为10克的不锈钢棒从5～m高处垂直下落,打击在直径为2mm覆盖于T10节段的垫片上,后者将打击力传递给脊髓,造成大鼠脊髓损伤。随机分组:(A)实验组;分脊髓损伤后12h、1d、3d、7d、14d五个时间点,伤后lh给予ES(15mg/kg)溶于5ml生理盐水强制灌胃,日一次。(B)对照组:伤后以同样方法给予等量生理盐水,日一次。
三、血清总补体溶血活性测定
在大鼠SCI前1h、伤后12h及伤后每天尾静脉抽血,应用CH50法进行血清总补体溶血活性测定。
四、组织病理学检查
各组动物分别于伤后12h、1d、3d、7d、14d再次麻醉,以伤处为中心取1cm脊髓组织,制作12μm冰冻切片,分别行HE染色及补体C3、C9免疫组化染色。半定量显微图像分析方法测定阳性反应物平均灰度值(AG)。
五、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性测定
各组动物于伤后各个时间点再次麻醉,以伤处为中心取1cm脊髓组织,称重后剪碎,加入含0.5％溴化十六烷基三甲胺的磷酸盐缓冲液中匀浆,超声细胞粉碎仪粉碎后孵育,12500 r/min速度下离心30min,取0.1ml上清加入0.6ml含1.25mg/ml的盐酸联大茴香胺和0.05％过氧化氢的磷酸盐缓冲液(pH=6.0)2min。使用分光光度仪在波长460nm测量MPO活性,并以脊髓组织重量作标准化(U)/g。
六、ICAM-1 mRNA实时定量荧光PCR检测
应用实时定量荧光PCR技术检测脊髓损伤组中ICAM-mRNA表达水平。损伤组织取材、总RNA提取及测定、cDNA合成、引物序列设计及合成、PCR检测等步骤被依次进行。
ICAM-1:上游引物5TGCCTACCCTCCCACAACAG
下游引物5ATACTATGTGGACGAGCATGT
GAPDH:上游引物5AGTTCAACGGCACAGTCAAGG
下游引物5AGACTCCACGACATACTCAGC
七、运动功能BBB评分
根据BBB(Basso,Beattie and Bresnahan)评分法评定大鼠脊髓损伤后的后肢运动功能。在动物伤前1h及伤后每天由2名实验人员进行盲法评分。
八、运动诱发电位(MEP)检测
应用脊髓运动诱发电位(MEP)评价损伤后每个时间点的脊髓功能状态。
九、统计学分析
所有数据均用平均值士标准差(-X±S)表示,应用SPSS10.0统计分析软件,各时间点组间行t检验,P＜0.05为有显著性差异。
结果：
一、血清总补体活性检测结果
从伤后12h至14d,实验组的CH50比值均明显低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)。
二、组织病理学检测结果
在伤后12h、1d、3d、7d、14d各个时间点,实验组脊髓损伤组织中C3及C9表达弱于对照组(P＜0.01)。
三、MPO活性测定结果
实验组在伤后12h、1d、3d、7d、14d各个时间点MPO活性均弱于对照组(P＜0.05或(P＜0.01)。
四、ICAM-1 mRNA实时荧光定量PCR检测结果
实验组在伤后12h、1d、3d、7d、14d各个时间点ICAM-1 mRNA表达均低于对照组(P＜0.01)。
五、运动功能BBB评分结果
在伤后的12h-6d,实验组和对照组的BBB评分没有显著差异;伤后7-9d实验组BBB评分要优于对照组(P＜0.05),伤后10-14d实验组BBB评分显著优于对照组(P＜0.01),
六、MEP检测结果
在伤后的12h、1d、3d时间点,实验组和对照组的电生理检测指标没有显著差异;在伤后7d和14d时间点,实验组电生理检测指标(AM、LT)显著优于对照组(P＜0.01)。
讨论
急性SCI是后果严重的创伤,目前还缺少快速有效的治疗方法。SCI的继发损伤机制复杂,免疫炎症反应在脊髓损中起到了重要的作用,抑制炎症反应可以减轻继发性脊髓损伤。中性粒细胞是急性炎症反应的主要细胞。MPO的活性和ICAM-1的表达水平可充分反应中性粒细胞等炎性细胞的浸润程度和活性状态,可作为评价损伤组织免疫炎症反应的相对特异性和敏感性的指标。
急性SCI时存在补体系统的激活。激活过程中产生的大量活性成分C3a、C4b、C5a等诱导上调很多细胞因子和炎症介质而加重免疫炎症反应。亚溶解量的膜攻击复合体(MAC)可引起靶细胞释放白三烯、前列腺素、活性氧等,而这些物质均能加重SCI后的免疫炎症反应。补体激活后MAC可造成神经细胞的溶破死亡。当MAC攻击靶细胞膜时,在靶细胞膜上可形成小的双向的跨膜通道,引起Ca2+不可抑制性地大量内流以及细胞内K+外流、Na+通透性增加等变化,细胞内Ca2+的积聚,可引起Ca2+依赖性蛋白酶和磷脂酶的活化,破坏线粒体的功能和细胞的能量代谢,最终导致细胞死亡。Nauta等研究发现,MAC可以通过激活和裂解caspase途径而诱导细胞调亡。
许多研究可表明,抑制补体激活可以减轻继发性SCI而起到神经保护作用。痘病毒补体调控蛋白(WCCP)能够显著减轻脊髓损伤组织的炎症反应,有利于保持脊髓组织的完整性和功能恢复。补体抑制剂CR2-Crry能够抑制小鼠SCI后补体C3的表达,减轻继发性脊髓损伤。补体C1酯酶抑制剂(C1-INH)能够减轻脊髓损伤组织多核巨噬细胞的聚集和浸润,通过抑制补体经典途径和旁路途径促进神经功能的恢复。我们在前期的研究中亦发现,重组补体受体Ⅰ型(sCR1)能够通过抑制补体激活机制减轻SCI组织中免疫炎症反应,减轻继发性SCI。
本研究表明,草麻黄补体抑制成分ES可以抑制SCI后的补体激活,减轻免疫炎症反应,减轻继发性SCI而保护神经功能。本研究为SCI的抗补体治疗提供了新的理论依据。
结论：
1、草麻黄补体抑制成分ES能够显著抑制大鼠脊髓损伤后补体系统的激活。
2、草麻黄补体抑制成分ES能够明显减轻大鼠脊髓损伤后免疫炎症反应。
3、草麻黄补体抑制成分ES能够对大鼠脊髓损伤后的神经功能发挥显著保护作用,减轻继发性脊髓损伤。