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背景与目的阻塞性睡眠呼吸暂停（obstructive sleep apnea,OSA）是目前最常见的睡眠疾病之一,其特征为睡眠过程中因颏舌肌（genioglossus,GG）功能受到抑制而导致的上呼吸道部分阻塞或塌陷的呼吸暂停。研究资料显示OSA与脑内orexin的调控异常有关。orexin属于神经肽,主要由orexin神经元产生和释放,其胞体在脑内分布局限,主要在下丘脑外侧区（lateral hypothalamus,LH）,穹窿周围区（perifornical nucleus,PeF）和背内侧区（dorsomedial hypothalamus,DMH）,但其纤维投射却几乎遍及整个神经系统,与几乎已知的脑内觉醒系统和睡眠系统之间都有密切的联系。谷氨酸是脑内主要的兴奋性氨基酸类神经递质。研究发现LH区内orexin神经元上表达谷氨酸受体。电镜免疫组织化学显示,谷氨酸轴突末梢与整个LH神经元的树突和胞体均可形成突触结构。受体结合研究也表明谷氨酸与其受体在LH区有一定程度的结合。除此以外,orexin神经元附近发现有囊泡谷氨酸2型转运体（vesicular glutamate transporter 2,VGlut2）的轴突末梢,且大多数含VGlut2的谷氨酸神经元的轴突末梢与orexin神经元胞体和树突都形成突触联系。而且谷氨酸和orexin共定位在同一个突触末梢但储存在不同的囊泡里,两种神经递质可以共释放,此外orexin神经元还可以利用谷氨酸作为神经递质介导自身的信号传导。我们之前的研究表明,LH区释放的orexin可以激活延髓舌下运动神经元的OX1和OX2受体,促进GG活动增强,提示orexin参与控制上气道的开放。那么LH区的谷氨酸是否参与调控GG的活动呢?而这种调控活动是否由LH区orexin神经元介导?LH区的谷氨酸来自哪个核团?这些问题目前并不十分清楚。结合电子显微镜以及生物素葡聚糖胺（Biotin dextran amine,BDA）顺行示踪研究表明,LH区分布的谷氨酸可能来源于外侧臂旁核（lateral parabrachial nucleus,LPB）,但并不清楚LPB释放的谷氨酸是否调控了LH区orexin神经元的功能。所以本实验欲探讨LH区内谷氨酸是否参与GG活动的调控作用,并借助离体光遗传学和化学遗传学（designer receptors exclusively activated by designer drugs,DREADD）技术揭示LH区的谷氨酸来源,及谷氨酸能神经元和orexin神经元之间的功能联系,希望为OSA的发病机制及其临床治疗提供新的理论依据。材料与方法实验采用健康成年雄性SD大鼠、VGlut2-Cre和野生型C57BL/6小鼠。1.SD大鼠麻醉后在LH区进行微量注射,同时记录同侧GG的肌电活动,观察不同浓度的外源性谷氨酸对GG肌电活动的影响;2.SD大鼠麻醉后在LH区进行微量注射谷氨酸受体特异性拮抗剂,同时记录同侧GG的肌电活动,观察内源性谷氨酸对GG肌电的作用;3.SD大鼠麻醉后在LH区进行微量注射,同时记录同侧GG的肌电活动,先给予外源性谷氨酸再给予不同类型的谷氨酸受体特异性拮抗剂,观察拮抗剂对外源性谷氨酸所引起的GG肌电变化的影响;4.光遗传学方法结合离体电生理实验研究LPB区谷氨酸能神经元与LH区orexin神经元的功能性突触联系。将AAV-hSyn-DIO-ChR2-mCherry病毒注射到VGlut2-Cre小鼠双侧LPB后,3周后进行离体电生理记录,研究LH中能接受LPB谷氨酸能神经元mCherry阳性纤维末梢投射的神经元对473nm蓝光的反应性;5.DREADD方法研究LPB-LH神经环路功能性表达。将AAV-hSyn-hM3Dq-mCherry病毒注射到野生型小鼠（wild type mice,WT）双侧LPB,3周后进行腹腔注射氧化氯氮平（Clozapine-N-oxide,CNO）,通过研究LPB和LH核团中神经元表达的c-Fos数量的变化,及LH区中orexin神经元的c-Fos表达率来反映LPB-LH神经环路的功能性表达情况。结果1.外源性谷氨酸对大鼠GG肌电的作用:正常大鼠LH区微量注射不同浓度的谷氨酸（1 mmol/L、10 mmol/L、100 mmol/L）后使GG活动明显增强（P<0.05,n=6）,但血压和心率并未出现明显变化（P>0.05,n=6）;2.谷氨酸受体特异性拮抗剂对大鼠GG肌电的作用:2.1正常大鼠LH区微量注射AMPA谷氨酸受体特异性拮抗剂CNQX（1mmol/L）未使GG活动减弱（P?0.05,n=6）;2.2正常大鼠LH区微量注射NMDA谷氨酸受体特异性拮抗剂D-AP5（1 mmol/L）使GG活动减弱（P<0.01,n=7）;3.谷氨酸受体特异性拮抗剂减弱外源性谷氨酸对正常大鼠麻醉状态下GG肌电的作用:3.1正常大鼠LH区微量注射谷氨酸（10 mmol/L）后引起GG肌电活动增强,再注射AMPA谷氨酸受体特异性拮抗剂CNQX（10 mmol/L）后未能减弱谷氨酸所引起GG的活动增强（P?0.05,n=5）。3.2正常大鼠LH区微量注射谷氨酸（10 mmol/L）后引起GG肌电活动增强,再注射NMDA谷氨酸受体特异性拮抗剂D-AP5（10 mmol/L）后能减弱谷氨酸所引起GG的活动增强,使GG肌电趋于正常（P<0.05,n=5）。4.LPB区谷氨酸能神经元与LH区orexin神经元的功能性突触联系:荧光显微镜下观察到LH区有大量的mCherry阳性纤维,膜片钳实验中记录到LH区神经元经蓝光照射后引发兴奋性突触后电流（excitatory postsynaptic current,EPSCs）,该电流可以被AMPA和NMDA谷氨酸受体拮抗剂完全阻断,提示LPB与LH核团存在功能性兴奋性突触联系。进一步分析发现在记录到的45个细胞中,LPB谷氨酸能神经元与LH区形成功能性突触联系的神经元中,有32.4%的神经元为orexin神经元。5.DREADD方法研究LPB-LH神经环路功能性表达。与溶剂对照组和病毒对照组相比,实验组在LPB区和LH区神经元的c-Fos表达均有明显增加（P<0.05）。除此之外与对照组相比,实验组LH区orexin神经元的c-Fos表达也有所增加（P<0.05）。结论1.LH区外源性和内源性谷氨酸均可使颏舌肌活动增强;2.LH区谷氨酸主要通过作用于NMDA型谷氨酸受体增强颏舌肌活动;3.LPB区谷氨酸能神经元向LH区orexin神经元投射;4.LPB区谷氨酸能神经元可能是通过激活LH区orexin神经元来发挥对颏舌肌的调控作用。