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玉米是重要的的粮食、精良的饲料和优质的工业原料,在农业生产中占有重要的位置。自1998年,玉米总产量已横跨小麦和水稻居世界首位[1]。常规的遗传育种技术已不能满足当代育种的需求,而转基因育种已发展成为现代玉米育种的重要技术之一。玉米遗传转化受体的建立是转基因工程的重要前提,目前,常见的玉米转基因育种受体材料有很多,如原生质体、茎尖、幼胚和胚性愈伤组织[2]等,由于玉米幼胚和胚性愈伤组织的再生能力、继代能力和扩繁能力都较强,故玉米胚性愈伤组织目前是玉米转基因材料的最佳选择。因此,培育高诱导率的胚性愈伤组织受体材料,鉴定与其调控相关的关键基因极为重要。本课题组前期研究结果表明,zma-mi R164对胚性愈伤组织的形成具有促进作用,并通过降解组测序鉴定了zma-mi R164的靶基因为ZmNAM3和ZmNAM4。本研究进一步通过突变体、转基因过表达、CRISPR/Cas9基因敲除等方法初步验证ZmNAM3和ZmNAM4在拟南芥和玉米幼胚胚性愈伤组织诱导过程中行使的生物学功能。主要研究结果如下:1.拟南芥AtNAC1和AtNAC是玉米ZmNAM3和ZmNAM4的同源基因通过建立NAM基因家族系统进化树,发现ZmNAM3和ZmNAM4为拟南芥NAC基因家族同源基因。由于At NAC1和At NAC在拟南芥中的功能注释为茎顶端分生组织相关基因,故推测玉米ZmNAM3、ZmNAM4调控分生组织而影响玉米胚性愈伤组织形成。2.玉米幼胚及愈伤组织中ZmNAM3和ZmNAM4的表达量差异可能是导致材料间胚性愈伤组织诱导率差异的重要原因以3份高诱导率自交系（18-599R、SCL027,SCL155）和2份低诱导率自交系（SCL339和B73）进行ZmNAM3、ZmNAM4基因序列差异分析,结果表明大多数变异位点在不同材料中随机分布,与愈伤组织诱导率不存在相关性。进一步对目标性状与基因表达量进行研究,发现在任何一个阶段,低诱导率材料中ZmNAM3和ZmNAM4的表达量均远远高于高诱导率材料。因此我们认为,ZmNAM3和ZmNAM4可能是胚性愈伤组织诱导过程中的负调控因子,其在幼胚及愈伤组织中的表达量差异可能是导致材料间胚性愈伤组织诱导率差异的重要原因。3.ZmNAM基因在拟南芥中的同源基因At NAC1对拟南芥胚性愈伤组织诱导起负调控作用ZmNAM基因在拟南芥中的同源基因的突变体atnac1经纯合鉴定后对表型进行调查,在正常的诱导培养基上诱导整株时,发现Columbia和突变体都能形成愈伤组织,但与野生型相比,突变体形成愈伤组织能力要强于对照,突变体材料形成愈伤组织比对照较早,而且胚性愈伤组织体积较大;当对其叶、茎、根分别进行诱导时,在相同培养基条件下,与同期对照相比,突变体形成愈伤组织较早,且体积较大,愈伤组织状态较好。说明缺失At NAC1基因后,拟南芥愈伤组织的诱导效果变好,证明At NAC1抑制愈伤组织的形成。4.成功构建了7个过表达载体和2个CRISPR/Cas9敲除载体分别构建了ZmNAM3和ZmNAM4的过表达载体ZmNAM3-p CAMBIA3301、ZmNAM4-p CAMBIA3301以及CRISPR/Cas9敲除载体ZmNAM3-CPB和ZmNAM4-CPB,用于遗传转化玉米。此外,还构建了ZmNAM3-p RI-101-AN、ZmNAM4-p RI-101-AN、At NAC1-p RI-101-AN和At NAC-p RI-101-AN的过表达载体遗传转化野生型拟南芥。构建ZmNAM3-p CAMBIA1305互补载体遗传转化纯合突变体。经PCR检测、测序、酶切鉴定,均与预期结果一致,表明植物表达载体都已构建成功。其中,ZmNAM4-CPB载体经原生质体验证其能够有效进行基因敲除。5.拟南芥阳性转基因植株的获得及表型构建的ZmNAM3-p RI-101-AN、ZmNAM4-p RI-101-AN、At NAC1-p RI-101-AN和At NAC-p RI-101-AN的过表达载体通过蘸花法转化野生型拟南芥分别得到3株、7株、2株、5株T0代转基因阳性植株。对过表达At NAC的转基因拟南芥的2个转化事件T1代进行表型鉴定,发现在2,4-D诱导下过表达At NAC的拟南芥叶片以及其诱导的愈伤组织表面均长了丰富的表皮毛,与野生型相比愈伤组织生长更缓慢,胚性状态更差;ZmNAM3-p CAMBIA1305互补载体侵染拟南芥纯合突变体得到5株T0代转基因阳性植株,T1代植株的叶片及诱导的愈伤组织表面也生长了大量的表皮毛,与突变体对照相比,在诱导的第16 d其脱分化状态更低。6.过表达ZmNAM3的玉米幼胚诱导胚性愈伤组织能力降低以过表达载体ZmNAM3-p CAMBIA3301遗传转化胚性愈伤组织高诱导率材料SCL027、SCL208,结果表明过表达ZmNAM3后当代幼胚诱导胚性愈伤组织的能力下降。以敲除载体ZmNAM3-CPB遗传转化低诱导率材料SCL090、SCL339,发现侵染ZmNAM3后,当代幼胚诱导胚性愈伤组织的能力无显著变化。7.玉米阳性稳定转基因植株的获得以过表达载体ZmNAM3-p CAMBIA3301、ZmNAM4-p CAMBIA3301和CRISPR/Cas9敲除载体ZmNAM3-CPB和ZmNAM4-CPB遗传转化C01的幼胚,过表达载体共得到8株T0代阳性植株,ZmNAM3-p CAMBIA3301、ZmNAM4-p CAMBIA3301分别为5、3株;CRISPR-Cas9敲除载体共得到5株阳性苗,但因炼苗移栽太迟,以及天气原因没有成活,目前仅有过表达载体得到种子,正在种植T1代,故未能挑胚诱导调查胚性愈伤组织的诱导率。