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硫胺素(即维生素B1)是全部有机体必须的辅助因子,其与噻枯唑都具有噻唑环的活性基团,噻枯唑离体和活体都对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)有很好的抑制作用,并且硫胺素在活体条件下对病原菌具有抑制作用。因为硫胺素与噻枯唑具有相似的化学结构,所以本研究为探索硫胺素及其Xoo合成关键基因如何影响Xoo对噻枯唑的药敏性,以及Xoo硫胺素合成关键基因功能,主要从以下三个方面进行研究。1.硫胺素对Xoo噻枯唑药敏性的影响为研究噻枯唑的作用机制是否与硫胺素有关,以及硫胺素如何影响Xoo对噻枯唑的药敏性,我们对二者进行离体和活体颉颃作用实验。结果表明,在离体条件下硫胺素能够部分反转噻枯唑对Xoo野生型菌株ZJ173的抑菌作用,但是不能恢复到不加药的状态。在活体条件下,硫胺素和噻枯唑均可阻止Xoo生长,单独用30mMol硫胺素处理水稻叶片时,抑制率为61.32%,单独用100μg/mL或300μg/mL噻枯唑处理时,抑制率分别为75.62%及85.43%。但是,共同用30mMol硫胺素和100μg/mL或300μg/mL噻枯唑处理水稻叶片时,对Xoo的抑制率却为28.40%及49.39%。结果表明硫胺素对Xoo噻枯唑药敏性具有颉颃作用。在离体条件下,使用噻枯唑处理的野生型菌株ZJ173体内硫胺素合成关键基因的表达显著上调。这些结果共同说明噻枯唑的作用机制可能与Xoo体内的硫胺素合成途径相关。2.Xoo硫胺素合成关键基因thiD、thiE及thiG的克隆与功能研究硫胺素与其硫酸化形式硫胺素焦磷酸(TPP),是碳水化合物代谢途径中关键酶必须的辅助因子。本研究中,通过对Xoo硫胺素合成关键基因thiD、thiE和thiG的敲除及回复,并测定缺失突变体生物学表型。实验得出Xoo三个硫胺素生物合成关键基因(thiD、thiE和thiG)与致病性有关。序列分析得出thiD、thiE和thiG在Xanthomonasspp.中是非常保守的,相似度>80%。Xoo敲除thiD、thiE和thiG基因的突变体(△thiD、 △ thiE和△ thiG)胞外多糖(EPS)产量显著性降低,同时生物膜产量升高。此外,△ thiE及△thiG丙酮酸代谢和生长速率都有所变化,与野生型菌株ZJ173相比两个缺失突变体的丙酮酸积累升高。缺失thiE后thiG表达显著性下调,而缺失thiG后thiE亦显著性下调。结果表明,硫胺素合成关键基因是Xoo发挥致病性必须的,并影响菌体能量代谢,同时thiE与thiG的表达相互调节。3.硫胺素合成关键基因对Xoo噻枯唑药敏性的影响硫胺素对Xoo噻枯唑药敏性具有颉颃作用,并且前人研究表明硫胺素合成相关基因是药剂作用靶标的源头。本研究结果表明离体条件下噻枯唑可为△thiE及△ thiG提供营养物质促进生长,而硫胺素为△thiD、△thiE和△thiG提供外源营养物质,促进其生长。活体条件下O.1mMol、30mMo1硫胺素及300μg/mL噻枯唑对△ thiE的抑制作用显著性降低,分别为17.87%、54.79%及16.7%。因此,推断噻枯唑的作用靶标可能是硫胺素合成基因thiE。