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硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)长期以来仅被视为一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体,直到分别在大鼠、人和牛脑中检测到了内源性产生的H2S[1-3],才认识到H2S具有一定的生理作用。在哺乳动物体内,内源性H2S主要是通过两个细胞内酶,胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase,CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)分解L-半胱氨酸而产生。生理环境下,它在哺乳动物的血液和组织中的浓度是10-160μM[4-7]。CBS和CSE的分布具有组织特异性,神经系统内主要存在CBS,CSE表达很少[4];在心血管系统如主动脉、肺动脉、肠系膜动脉、尾动脉和门静脉上有CSE表达而无CBS分布[5];而回结肠、肝脏及肾脏则同时存在有CBS和CSE[8-10]。内源性H2S具有多种生理功能,广泛参与许多疾病的发生发展过程,被认为是继一氧化氮(Nitric oxide,NO)和一氧化碳(Carbon monoxide,CO)之后的第三种气体信号分子。与NO类似,H2S具有双重作用,如既可以促进增殖,又可以抑制增殖[11];在生理浓度时通过抑制白细胞活化起抗炎作用,而一旦在炎症区域过量时则起到促炎作用,被看成是炎症反应的一把双刃剑[12];现在认为H2S在各种组织和各种环境中的作用主要取决于它的局部浓度[6]。以往对H2S的研究主要集中在神经系统和心血管系统,现已发现它在消化系统的生理作用如舒张平滑肌、保持粘膜完整性、调控血流量、调节炎症反应和镇痛等[6, 9, 13, 14],但对其在胃肠动力紊乱中的病理生理作用和机制则了解不多。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal,ICC)不仅是胃肠道慢波的起搏细胞,而且做为神经控制肌肉活动的中介,起着调控胃肠动力的作用。ICC的减少与胃肠动力紊乱性疾病相关,如胃轻瘫、慢性特发性假性肠梗阻、失驰缓症、慢传输型便秘、术后肠梗阻、炎性肠病等[15]。几乎所有与ICC减少有关的胃肠动力紊乱疾病,都伴随着肠神经元的减少[16-19]。对胃肠道超微结构的研究[20, 21]也已经证实在肠神经元和ICC之间的密切关系,最近Beckett等[22]在电镜下观察到在肠运动神经元和ICC-IM(intramuscular,肌内)间形成突触样的连接(<10nm),进一步为ICC受神经支配的观点提供了直接证据。Schicho等[23]报告在豚鼠和人,超过90%的粘膜下和肠肌层神经元共标记CBS和CSE,ICC-MY(myenteric,肌间)也标记CSE。既然NO和CO是ICC的细胞保护因子[24],那么H2S和ICC的存活之间有何关联呢?它们是如何影响肠动力的呢?机制是什么?国内外均未见报道。因此分别通过ICC原代细胞培养和小鼠小肠切除模型来研究H2S和肠道ICC之间的关系,旨在探讨H2S对肠道ICC的影响及其在术后肠动力紊乱中的作用。目的:1.研究低浓度的H2S(以NaHS为供体)对小鼠肠道ICC原代细胞培养的增殖作用的影响,证实低浓度的H2S是否可促进ICC的增殖。2.探讨低浓度的H2S促进ICC增殖作用的机制。3.研究小鼠小肠吻合口近端肠组织H2S生成酶(CSE和CBS)表达的改变,术前腹腔注射H2S的供体和CSE抑制剂(NaHS和PPG)对CSE和CBS表达、ICC网络的影响。方法:本课题利用原代培养小鼠ICC,在常规光镜检查的基础上,采用免疫组化方法对原代培养的ICC进行鉴定,MTT法测培养的ICC活力,进一步采用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术分析H2S对ICC数量的影响,采用Western blot法检测H2S作用后ICC内第二信号分子的活化情况;利用肠吻合小鼠模型,RT-PCR法测肠组织CSE/CBS mRNA表达的差别,分别腹腔注射H2S的供体和CSE抑制剂(NaHS和PPG),检测CSE/CBS mRNA的表达、MPO、H2S的生成的变化,并利用免疫荧光染色结合激光共聚焦显微镜技术分析对ICC网络的影响。结果:1.免疫组化结果证实体外成功分离培养小鼠肠道ICC。2.在ICC上免疫荧光双重标记c-kit和CD44成功。3. MTT法证实低浓度的H2S(以NaHS为供体)不影响ICC的活力。4.激光共聚焦观察显示,低浓度的H2S可促进ICC的增殖。5. Western blot实验结果显示,低浓度的H2S增加p-Akt的表达,PI3K(Akt上游信号分子)阻断剂LY294002能阻断这一作用,并取消了低浓度的H2S所引起的ICC增殖;低浓度的H2S不增加p-ERK和p-p38的表达。6. RT-PCR结果显示,小鼠小肠组织表达CSE mRNA,不表达CBS mRNA。7. RT-PCR结果显示,在小鼠肠吻合模型中,吻合口近端3cm处CSE mRNA的表达上调,而近端30cm处CSE mRNA的表达与假手术组相比,无明显差异。8. RT-PCR结果显示,吻合口近端CSE mRNA表达的上调有时间依赖性,CSEmRNA的表达在术后1小时开始增加,术后6小时达峰值,而后逐渐下降,至术后24小时,与假手术组无明显差异。9. RT-PCR结果显示,分别给手术组和假手术组小鼠腹腔注射H2S的供体和CSE抑制剂(NaHS和PPG)及生理盐水(作为对照),其中假手术组小鼠、手术组小鼠之间吻合口近端30cm处的CSE mRNA表达、MPO、H2S的生成没有差别;而手术组小鼠之间吻合口近端3cm处的CSE mRNA表达、MPO、H2S的生成有明显差别,手术+NS组最高,其次是手术+NaHS组,手术+PPG组CSE mRNA的表达最低。免疫荧光染色分析结果显示手术+NS组ICC平均阳性面积百分比在手术组小鼠之间在吻合口近端3cm处显著低于手术+PPG组。结论:1.低生理浓度的H2S(以NaHS为供体)不影响ICC的细胞活力,可促进ICC增殖。2.低生理浓度H2S的促ICC增殖作用可能依赖于PI3K/Akt信号途径。3.肠吻合手术可上调吻合口近端肠组织CSE mRNA的表达。4.腹腔注射PPG可下调吻合口近端肠组织CSE mRNA的表达,可能对ICC具有保护作用。