研究一 中医药干预406例常规治疗失败晚期结直肠癌前瞻性队列研究[目的]1.通过前瞻性队列研究对常规治疗失败晚期结直肠癌中医药治疗的临床疗效进行评价,对中医药在晚期结直肠癌治疗的作用和地位进行验证与论述。2.对中医药治疗获益的优势人群临床特征进行归纳,对影响生存的预后因素进行分析。[方法]本试验采用前瞻性、多中心、队列研究方法,在9家大型中医及西医诊疗中心同时展开,纳入常规治疗失败的晚期结直肠癌患者,入组时按患者治疗意愿将其分为中医组、中西医结合组和西医组3组队列。每3个月为1周期,将从患者入组开始随访直至患者死亡或研究终止。主要评价指标为患者总生存期(OS),次要疗效评价指标为无进展生存期(PFS)。[结果]1.一般资料本次数据分析截止时间为2019年11月30日,共纳入分析406例患者,经统计最终形成队列为西医组139人,中西医结合组155人,中医组112人。中位随访时间:西医组19.67个月,中西医结合组20.47个月,中医组20.4个月。中西医结合组中位中药暴露时间为6.43个月,最长暴露时间为29.73个月。中医组中位中药暴露时间为3.73个月,最长暴露时间为33个月。在人口信息、及肿瘤基本情况三组基本均衡。2.生存分析2.1总体中位生存期分析总体中位生存期(mOS,median Overall Survival),西医组的mOS为11.37个月,中西医结合组的mOS为14.03个月,中医组的mOS为6.33个月(P<0.001)中西医结合组vs西医组降低死亡风险约为26%(HR=0.74,95%CI 0.55-0.98,P=0.038)。中西医结合vs中医组,死亡风险降低约为49%(HR=0.51,95%CI 0.38-0.69,P<0.001)。西医组 vs 中医组,降低死亡风险约 47%(HR=1.47,95%CI 1.09-1.99,P=0.012)。2.2总体无进展生存期分析通过对总体无进展生存期(PFS,progression-free survival)进行分析发现,西医组的PFS为5.37个月,中西医结合组的PFS为5.8个月,中医组的PFS为5.03个月(P>0.05),死亡风险的两两比较各组间也均未见明显统计学差异(/>0.05)。2.3中西医结合组与西医组亚组生存分析中西医结合组较西医组在女性、KPS评分≥80分、转移器官≥2处、KRAS突变、既往抗肿瘤治疗≥3线组显著延长OS(P<0.05)并降低死亡风险(P<0.05)。2.4西医组与中医组亚组生存分析西医组在男性、年龄≥65岁、右半结肠、确诊Ⅳ期时间<18个月、既往抗肿瘤治疗≤2线、转移器官数目≥2处、肝转移、KRAS突变、BRAF状态未知、既往接受靶向治疗、中医证型为脾肾两虚、瘀毒内阻证型的患者较中医组在OS上显著延长(P<0.05),并且显著降低死亡风险(P<0.05)。2.5中西医结合组与中医组亚组生存分析中西医结合组在不论性别、年龄、左、右半结肠、确诊Ⅳ期时间长短、是否发生肝转移、既往是否接受靶向治疗均可较中医组显著延长生存时间(P<0.05),并降低病人死亡风险(P<0.05);对于KPS评分<80分、KRAS突变、BRAF野生及未知状态、既往抗肿瘤治疗≤2线、中药低暴露组、脾肾两虚证型亚组中能够显著延长OS及降低死亡风险(P<0.05)。2.6末次评价状态生存亚组分析进展的亚组生存分析中,中西医结合组较中医组显著延长生存(13.10个月vs6.87个月P=0.006),而中西医结合组与西医组、中医组与西医组在对末次评价为进展的患者生存延长均不具有统计学意义(P>0.05)。不耐受的生存亚组分析显示,中西医结合组较中医组、西医组较中医组均显著延长生存(P<0.05),但西医组与中西医结合组生存差异不具有统计学意义(P>0.05)。3.COX多因素回归分析3.1总体人群多因素分析结果肿瘤原发部位、KPS评分、既往靶向治疗为预后独立危险因素,右半结肠较左半结肠患者死亡风险增加约1.4倍,KPS评分<80分的死亡风险增加约1.96倍,既往未接受靶向治疗的患者死亡风险也会增加1.38倍;中医药暴露(HR=0.718,95%CI 0.535-0.962,P=0.0267)、西医抗肿瘤治疗(HR=0.55,95%CI 0.402-0.751,P<0.001)为独立的保护因素,可以降低患者死亡风险。3.2亚组人群多因素分析a.中西医结合组与西医组KPS<80分、既往抗肿瘤治疗线数≥3线为影响生存的独立危险因素;Ⅳ期确诊时间>18个月、中西医结合治疗为影响生存的独立保护因素。b.中西医结合组与中医组中西医结合组与中医组亚组人群多因素分析:KPS<80分、既往未进行靶向治疗是影响患者生存的独立危险因素,而接受中西医结合治疗、中医药暴露量是影响患者生存的独立保护因素。c.中医组与西医组KPS评分<80分、肿瘤原发部位为右半结肠及既往抗肿瘤治疗的线数≥3线都是独立的危险因素。4、生活质量评价a、FACT-C(V4.0)从患者入组后得分来看,中医组得分最低,中西医结合组最优、西医组次之,三组间差异具有统计学意义P=0.0003。1周期后试验结局指数,依然是中西医结合组占优势。b、中医症状分级量表中医症状改善有效率方面中西医结合组优势显著为24,70%,西医组为13%,中医组为 9.5%。[结论]1.三种治疗方式对于常规治疗失败晚期结直肠癌的PFS改善无显著性差异。2.三组在人口学信息、肿瘤原发部位、病理类型、分化程度等方面三组均基本一致的前提下,中西医结合治疗较西医治疗及中医治疗显著延长患者总体中位OS,并改善患者的生活质量。3.亚组分析中对于临床中疾病进程长、经过较多线治疗效果不佳、瘤体负荷重,基因状态预后不佳这些治疗难点的晚期结直肠癌患者,中西医结合治疗较单纯西医治疗仍然取得了较好的临床获益。4.单纯的中医治疗面对肿瘤负荷重、既往抗肿瘤治疗不规范的晚期患者在多个强烈预后不良的因素方面难以比肩西医治疗。化疗无法耐受的患者应该选择中西医结合的治疗方法,减毒增效,才能使生存预后最大的获益。5.总体预后因素中右半结肠、KPS评分<80分、既往未进行靶向治疗为预后独立危险因素,中医药暴露量、西医抗肿瘤治疗为预后独立保护因素,中西医结合治疗为亚组独立保护因素。研究二83例中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌ctDNA状态与预后相关性探索[目的]通过对中医药干预常规治疗失败晚期结直肠癌患者的ctDNA检测,对其突变基因状态及与预后相关性进行探索。[方法]纳入中医药干预连续3个月以上的常规治疗失败晚期结直肠癌患者,抽取外周血10ml。由临床检测中心提供的方案,进行外周血ctDNA肿瘤相关突变基因检测,定制的NGS检测面板覆盖416个肿瘤相关基因。[结果]1.一般资料共纳入了来自4家中心共83例患者,其中年龄≥65岁者29人(34.94%),<65岁有54人(65.05%,男性48人(57.83%),女性35人(42.17%)。中医组37例,中西医结合组46例。2.外周血细胞肿瘤基因突变情况在83例患者中,有54例(65.06%)血浆中检测出肿瘤相关突变基因,共152个基因419个突变位点,有29例(34.94%)未检测出肿瘤相关突变,根据突变频率筛选出TOP20 的基因为 APC、TP53、KRAS、PIK3CA、FBXW7、SMAD4、LRP1B、PTPN13、EGFR、CTNNB1、ROS1、PKHD1、EPHA3、SMARCA4、FAT1、HDAC9、PREX2、NOTCH1、SMAD3、SF3B1。另外有6例患者存在胚系基因突变,分别为APC(46.49%)、RAD51C(42.93%)、PDE11A、ABCB1、TTF1,其中APC、RAD51C为已知的致病性基因。3.突变基因的生物信息学分析突变基因蛋白质互作的功能集中在蛋白质自磷酸化、FLT3信号、白细胞介素信号、肽基酪氨酸磷酸化、肽基酪氨酸修饰、DNA完整性检查点、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路、细胞对有毒物质的反应以及蛋白激酶B信号转导通路生物过程及通路上。4.ctDNA突变与预后关系ctDNA高突变组预后优于低突变组(17.47个月vs8.57个月,P=0.033)。受试者的肿瘤组织的突变负荷(tumor mutational burden,TMB)高低两组在中位OS上存在显著差异(16.63个月vs10.00个月P=0.007),KRAS状态显著影响患者预后,突变型更差(8.57个月vs16.63个月P=0.047),同样突变型的PIK3CA患者生存要显著缩短(6.97个月vs15.80个月P=0.045)。本次研究APC、TP53的基因状态未发现与预后的显著相关性(P>0.05)。5.基因突变与临床因素分析在ctDNA等位基因突变频率与临床因素亚组分析中是否存在肝转移(P=0.014),以及中医证型存在显著相关性(P=0.037);肿瘤突变负荷TMB与临床因素的亚组分析中是否存在肝转移(P=0.007)、肺转移(P=0.049)、中医证型(P=0.012)、八纲辨证(P=0.044)与之存在显著相关性。KRAS突变与肝转移、淋巴结转移存在显著相关性(P<0.05);PIK3CA基因突变与年龄、淋巴结转移存在显著相关性(P<0.05)。TP53基因突变与肝转移、中医证型脾肾两虚型显著相关(P<0.05),而APC基因突变情况未找到与之显著相关的临床因素。[结论]1.酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶等蛋白酶相关生物途径及通路可能与晚期结直肠癌常规治疗失败的不良预后相关机制关联,需要后期进行相关机制研究加以验证。2.中医药治疗常规治疗失败后晚期结直癌患者ctDNA突变频率、TMB、KRAS、PIK3CA基因与预后相关,肝转移与基因不良突变相关。3.中医药健脾补肾治疗对降低ctDNA突变频率、减少抑癌基因突变存在相关性;八纲辨证为阴证的患者TMB负荷较低,可能难以从免疫治疗中获益。研究三常规治疗失败晚期结直肠癌疗效差异表达基因的生信分析[目的]对常规治疗失败晚期结直肠癌疗效差异机制进行研究,探索可能的对预后有影响的分子靶标及相关的通路,将对其临床治疗提供可能的新思路、新角度。[方法]本研究筛选常规治疗失败的晚期结直肠癌对比常规治疗病灶完全缓解的疗效差异基因,GO(Gene Ontology 基因本体论)分析和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,京都基因和基因组百科全书)分析是在筛选的差异基因上进行,功能集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis,GSEA)是利用样本所有基因更全面的分析基因的功能及生物过程,利用蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)网络筛选出关键的Hub基因。并分析Hub基因与结直肠癌预后的关系,以期对晚期结直肠癌常规治疗失败的疗效差异机制进行初步探索。[结果]1.一般资料检索GEO公共基因数据库(Gene Expression Omnibus,GEO),获得GSE72970数据集,其中包含12个常规治疗失败的晚期结直肠癌样本,和7个常规治疗完全缓解的晚期结直肠癌样本的基因数据。2.常规治疗失败晚期结直肠癌的疗效DEGs利用GE02R平台在线工具筛选GSE72970数据集中常规治疗失败晚期结直肠癌对比完全缓解的DEGs。筛选结果:常规治疗失败CRC对比完全缓解基因样本共获得323个DEGs,其中上调的有97个,下调的有226个。3.疗效DEGs的GO分析和KEGG分析对常规治疗失败mCRC对比完全缓解的mCRC的DEGs进行GO分析与KEGG分析。3.1 GO分析结果:DEGs富集到的Top6的细胞学组件(Cellular component CC)有:内质网、突触前活动区、染色质可及性复合体、Epsilon DNA聚合酶复合物、RNA聚合酶I转录因子复合物、染色质周围纤维。DEGs富集到的Top6的分子功能(Molecular function MF)有:蛋白酶抑制剂活性、分子功能未知、硫转移酶活性、半乳糖基转移酶活性、抗原结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。DEGs富集到的Top6生物学过程(Biological process BP)有:新陈代谢、能量途径、未知的生物过程、细胞凋亡、细胞周期调控、神经递质转运。3.2 KEGG分析结果:DEGs显著富集到的Top6生物途径有:有丝分裂前中期、鸟苷核苷酸从头生物合成、M相、着丝粒处新的含CENPA核小体的沉积、核小体组装、有丝分裂M-M/G1期。4.GSEA分析富集到的Top6的功能集:伴侣蛋白介导的自噬作用、儿茶酚胺代谢过程、T细胞介导的细胞毒性调控、选择胸腺内T细胞、共转录蛋白对膜的靶向作用、抗原受体介导的信号通路的阳性调控。5.PPI网络的构建及Hub基因筛选筛选到的疗效DEGs被借助STRING工具用于构建PPI网络,并使用Cytoscape的cyto Hubba 插件筛选 Top20Hub 基因,它们分别是:SPC25、CENPH、CENPK、SPDL1、CENPQ、PPP2CA、DSN1、KIF14、CDC6、UBE2V2、CDC23、HACE1、SMURF2、KBTBD6、KBTBD7、TRIP13、SHCBP1、CLCA1、NIP7、CLCA4。6.Hub基因预后分析利用GEPIA网站分析Hub基因对化疗失败mCRC的预后的影响。结果发现CLCA1基因表达量与患者OS相关(P=0.012),CLCA1高表达患者生存预后优于低表达。同时CLCA1(P=0.041)、TRIP13(P=0.038)基因的表达量与CRC患者的DFS密切相关。[结论]1.富集到的蛋白酶作用包括丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PKB/AKT)、酪氨酸激酶在内的相关通路,细胞凋亡自噬、细胞周期调控、蛋白转录修饰、靶基因PIK3CA、TP53,P53路径激活等生物过程与第二部分外周血ctDNA突变基因富集通路与生物过程相吻合,常规治疗失败难治性结直肠癌的相关通路机制探索得到初步验证。2.CLCA1、TRIP13的表达量与晚期结直肠癌预后相关,今后可能为潜在的预后生物标志物。