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目的:
构建RNA干扰真核表达载体,观察其对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12细胞)中CaMKⅡβ基因的抑制作用。
方法:
设计并合成针对CaMKⅡβ基因的正义链和反义链,退火并克隆到RNAi质粒表达载体,脂质体法转染PC12细胞株后,不同时间点提取RNA及蛋白质,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测其对CaMKⅡβ mRNA及蛋白质水平的影响。
结果:
成功构建KNAi质粒表达载体,转染PC12细胞后可以抑制CaMKⅡβ mRNA及蛋白质的表达。与阴性对照组相比,表达质粒产生的siRNA对CaMKⅡβ mRNA的抑制率24h、48h、72h和96h分别约为17.95%,46.40%,64.69%和49.37%,蛋白抑制率72h约为74.77%,统计结果分析表明,两组差异有统计学意义。RNAi表达载体可以有效地抑制PCI2细胞CaMKⅡβ基因的表达。