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目的: 探讨miR-149表达在CRC中的临床病理意义和预后价值，以及miR-149/FOXM1在CRC细胞迁移和侵袭过程中的功能和机制，为进一步阐明和完善CRC中miR-149表达紊乱及其功能异常的分子调控机制，寻找CRC新的治疗靶点提供实验依据。 方法和结果: 第一章 MiR-149在CRC中的表达及其临床意义 方法: 1.在收集的CRC组织、癌旁组织、正常结肠组织、一系列转移能力不同的CRC细胞(HCT116、LoVo、SW480)和正常结肠细胞(NCM460)中，利用实时定量RT-PCR检测miR-149的表达水平。 2.结合临床信息分析全部78例CRC组织中miR-149表达水平与临床病理特征和预后的关系。 3.在收集的CRC组织、癌旁组织和正常结肠组织中，运用实时定量RT-PCR检测FOXM1的表达水平，并分析其与miR-149表达水平之间的关系。 结果: 1.CRC组织(n=78)中miR-149的表达水平显著低于正常结肠组织(n=20)(P＜0.01);与对应癌旁组织(n=20)相比，CRC组织(n=20)中miR-149的表达水平显著降低(P＜0.01);同时，与无淋巴结或远处转移的CRC组织(nmCRC，n=38)相比，有转移的CRC组织中(mCRC，n=40) miR-149表达水平显著降低(P＜0.01)。此外，正常结肠细胞株NCM460的miR-149表达水平最高，低转移性CRC细胞株LoVo和SW480次之，高转移性CRC细胞株HCT116中，miR-149表达水平最低(P＜0.01)。 2.相关性分析发现，CRC组织中miR-149的表达水平与患者淋巴结转移(P=0.024)、远处转移（P=0.045）、TNM分期(P=0.033)呈显著相关;Kaplan-Meier生存曲线和Cox风险比例回归模型分析发现，miR-149低表达预示总生存期缩短(P＜0.01)，可作为判断CRC患者预后的独立危险因素(P=0.011;HR=2.658;95％ CI:1.308-3.087)。 3.CRC组织(n=78)中FOXM1的mRNA表达水平显著高于正常结肠组织(n=20)(P＜0.01);20对CRC和癌旁组织对比中，癌组织中FOXM1 mRNA表达水平显著增高(P＜0.01);同时，有淋巴结或远处转移的CRC组织(mCRC，n=40)中FOXM1 mRNA表达水平显著高于无转移的CRC组织(nmCRC，n=38)(P＜0.01)。此外，FOXM1的表达水平和miR-149表达水平呈负相关(r=-0.553，P＜0.01)。 第二章 MiR-149对CRC细胞和正常结肠细胞生物学特性的影响 方法: 1.通过合成miR-149 mimics和inhibitor并瞬时转染CRC细胞(HCT116、LoVo)和正常结肠细胞(NCM460)，人为改变细胞内miR-149表达水平，运用MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分别检测细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。 结果: 1.与对照组miR-NC mimics相比，转染miR-149 mimics的HCT116细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著下降(P＜0.01)。相反，在LoVo细胞中人为下调miR-149表达水平，可增强细胞的增殖、迁移和侵袭能力(P＜0.05)。 2.下调正常结肠细胞NCM460中miR-149表达水平，可增强细胞的迁移和侵袭能力（P＜0.05）。 第三章 MiR-149靶向调控CRC细胞FOXM1基因的表达 方法: 1.运用三个不同的miRNA/靶基因在线分析软件TargetScan(http://www.targetsean.org/)、PicTar(http://pictar.mdc-berlin.de/)和miRNAtargets(http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/)，分析FOXM1 mRNA3-UTR序列中潜在的miRNA结合位点，将预测结果作交集分析。 2.将miR-149 mimics、inhibitor及其对照分别与含FOXM1-3-UTR-wt和FOXM1-3-UTR-mut序列的荧光素酶质粒载体瞬时共转染HCT116细胞，运用荧光素酶活性实验，根据荧光素酶活性变化鉴定miR-149是否能与FOXM13-UTR序列结合。 3.运用实时定量RT-PCR和Western blot验证miR-149对FOXM1的调控作用。 结果: 1.通过生物信息学软件和交集分析发现，FOXM1 mRNA3-UTR序列上存在miR-149的潜在结合位点。 2.荧光素酶活性实验发现，miR-149能与FOXM1 mRNA3-UTR序列结合，使荧光强度显著下降。 3.MiR-149能直接靶向调控FOXM1基因的表达。 第四章 MiR-149调控CRC细胞侵袭转移的机制研究 方法: 1.构建FOXM1干扰质粒(pSil/shFOXM1)并稳定转染HCT116和LoVo细胞，人为下调细胞内FOXM1的表达水平，采用MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力的差异。 2.构建FOXM1基因真核表达载体(pEGFP/FOXM1)与空质粒对照(pEGFP/control)分别转染HCT116/miR-149 mimics细胞，实时定量RT-PCR和western blot技术检测FOXM1 mRNA和蛋白表达水平的变化。MTT实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验分析各组细胞增殖、迁移和侵袭能力的差异。 3.运用实时定量RT-PCR和Western blot技术分别检测HCT116/miR-149 mimics、HCT116/shFOXM1及其对照细胞中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表达水平。FOXM1基因真核表达载体(pEGFP/FOXM1)与空质粒对照（pEGFP/control）分别转染HCT116/miR-149 mimics细胞，实时定量RT-PCR和Western blot技术检测MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR mRNA和蛋白的表达水平。 4.实时定量RT-PCR检测miR-149高表达组(n=33)和miR-149低表达组（n=-45）CRC组织中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表达水平。 结果: 1.HCT116/shFOXM1和LoVo/shFOXM1细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著下降。提示阻断FOXM1的表达可模拟miR-149对CRC细胞的生物学效应。 2.FOXM1表达恢复可部分逆转miR-149过表达所介导的对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用。提示miR-149对CRC细胞生物学特性的作用部分是由FOXM1介导的，FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因。 3.上调miR-149或下调FOXM1均能抑制CRC细胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的表达。恢复FOXM1表达能逆转miR-149过表达对CRC细胞MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR表达的抑制作用。 4.MiR-149低表达组(n=45)CRC组织中MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR的mRNA表达水平均高于miR-149高表达组(n=33)。 结论和意义: 1.MiR-149在CRC组织尤其是有淋巴结或远处转移的组织中低表达，FOXM1在CRC组织中高表达，两者呈负相关。MiR-149的表达水平与CRC患者淋巴结转移、远处转移、TNM分期以及临床预后相关。 2.MiR-149可抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。 3.MiR-149能与FOXM1 mRNA3-UTR直接结合并调控FOXM1基因的表达。 4.MiR-149对CRC细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用部分是由FOXM1介导的，并与MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR密切相关。提示FOXM1是miR-149重要的功能性靶基因，MMP-2、MMP-9、VEGF-A和uPAR可能是miR-149/FOXM1影响CRC细胞迁移和侵袭的重要效应分子。 5.本研究首次分析了miR-149在CRC中的表达异常及其与临床病理特征和预后的关系，发现了miR-149对CRC细胞增殖、迁移和侵袭等生物学行为的影响，并探讨了miR-149在CRC细胞中发挥作用的分子机制。提示miR-149/FOXM1通路可能成为CRC治疗的新型分子靶点。