兰科几种珍稀药用植物的丛生芽诱导研究

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本研究以兰科几种珍稀药用植物(杜鹃兰、金钗石斛、白及)为试验材料,研究其丛生芽发生的影响因素和诱导途径,在成功建立了这几种植物丛生芽化学诱导方法的基础上,也对其丛生芽的转基因诱导进行了探索。主要研究结果如下:1、以杜鹃兰种子无菌萌发的原球茎为试材,研究不同培养基、不同种类及浓度的植物生长调节物质、不同浓度活性炭及不同培养条件对杜鹃兰原球茎增殖的影响。结果表明:以1/2MS+6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 1.0 mg·L-1+活性炭0.5 g·L-1为增殖培养基,温度15℃,光照强度2000 lx时有利于杜鹃兰原球茎的增殖,增殖的原球茎呈丛生型且长势较好,40 d内增殖率可达177.11%;以生长势好的增殖原球茎为试验材料,研究不同含量的大量元素、不同种类及浓度的植物生长调节物质、活性炭及正交优化试验(TDZ、IAA、蔗糖、大量元素)对杜鹃兰“芽丛”诱导增殖的影响。结果表明:1/4MS培养基附加TDZ 1.5 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1为杜鹃兰“芽丛”诱导增殖的适宜培养基,最大增殖系数达3.16。2、以金钗石斛种子为试材,通过正交试验研究75%乙醇处理时间、0.1%升汞处理时间、6-BA、NAA对金钗石斛种子萌发的影响。结果表明:种子分别经75%乙醇处理15 s、0.1%升汞处理10 min后,接种到不添加6-BA和NAA的MS培养基中进行萌发,得到的萌发率高;以大小相近、深绿色的原球茎为试验材料,MS+蔗糖30 g·L-1为基本培养基,采用正交试验研究6-BA、2,4-D和活性炭对金钗石斛愈伤组织诱导增殖的影响。结果表明:添加6-BA 1.0 mg·L-1、2,4-D 1.0 mg·L-1和活性炭0.2 g·L-1的培养基对愈伤组织的诱导增殖效果较好,诱导出的愈伤组织呈绿色且长势较好;以绿色愈伤组织为试验材料诱导丛生芽,MS+蔗糖30 g·L-1为基本培养基,采用正交试验研究6-BA、NAA和活性炭对金钗石斛丛生芽诱导的影响。结果表明:培养基中添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA0.1 mg·L-1和活性炭0.2 g·L-1有利于金钗石斛丛生芽的诱导,诱导率可达80.0%。3、以白及种子为试材,研究不同浓度的NAA对白及种子萌发的影响。结果表明:在MS+NAA 0.5 mg·L-1+活性炭0.5 g·L-1+土豆泥75 g·L-1培养基中,种子的萌发率较高;以长势基本一致的幼苗为试验材料,研究不同浓度的6-BA对白及丛生芽诱导的影响。结果表明:3/4MS培养基附加6-BA 0.1 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+IBA 0.15 mg·L-1+活性炭0.3 g·L-1+香蕉汁50 g·L-1为白及丛生芽诱导的适宜培养基,诱导率可达87.5%。4、以杜鹃兰、金钗石斛及白及原球茎为农杆菌遗传转化材料,研究了材料的生理状态、创伤方式、菌液OD600值、预培养时间、共培养时间、侵染时间对上述三种兰科药用植物遗传转化效率的影响。结果表明:少数杜鹃兰原球茎GUS染色呈蓝色,少数GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阴性,即杜鹃兰遗传转化极其困难(试验效果不佳);适于金钗石斛遗传转化的条件:以直径5 mm的金钗石斛原球茎为材料,预培养1 d后置于OD600为0.50.7的菌液中侵染10 min,期间用频率40 KHz的超声波处理3 min,共培养2 d,部分金钗石斛原球茎GUS染色呈蓝色,部分GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阳性,初步证实ipt基因已转入金钗石斛基因组中;适于白及遗传转化的条件:以叶长10 mm的白及幼苗为材料,预培养2 d后置于OD600为1.01.2的菌液中侵染10min,期间用频率40 KHz的超声波处理3 min,共培养2 d,部分白及幼苗GUS染色呈蓝色,部分GUS染色呈蓝色的植株PCR检测呈阳性,初步证实ipt基因已转入白及基因组中。
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