酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH, E.C.1.14.16.2)是一种以酪氨酸为底物的酶,能够催化酪氨酸形成多巴。该酶在脊椎动物和无脊椎动物中是高度保守的酶类,作为儿茶酚胺合成的限速酶,广泛存在于昆虫、哺乳动物和人类中,是新陈代谢不可缺少的酶类。目前,酪氨酸羟化酶在人类、果蝇、烟草天蛾、柑橘凤蝶等物种中已被报道,但在家蚕中却少有报道。随着后基因组时代的来临,家蚕作为一种鳞翅目模式昆虫已逐渐成为基因功能研究的理想资源。另外,家蚕基因组数据和基因芯片数据的公布,也为研究家蚕中的基因提供了信息平台。本研究基于家蚕基因组数据库和基因芯片数据,对影响黑色素形成途径中的关键基因家蚕酪氨酸羟化酶基因(Bombyx mori Tyrosine hydroxylase, BmTh)进行了生物信息学分析、表达特征分析、组织原位杂交、干涉实验和酶的活性测定。主要研究结果如下：1.家蚕酪氨酸羟化酶基因(BmTh)生物信息学分析基于NCBI和家蚕基因组数据库,对家蚕酪氨酸羟化酶基因进行了生物信息学分析,该基因全长2272 bp,包括8个外显子和7个内含子,开放阅读框长度为1686 bp,编码561个氨基酸,预测蛋白的分子量为63.4 kD,等电点(PI)为5.33,位于家蚕第1号染色体的nscaf1690上。经蛋白质结构域分析发现,家蚕BmTh与果蝇DmTh、蝴蝶PxTh、烟草天蛾MsTh等物种均含有生物喋呤氢结构域。进化分析表明,BmTh基因与鳞翅目中其他昆虫Th基因的进化关系较近,与哺乳动物Th基因的进化关系较远。2.家蚕酪氨酸羟化酶基因(BmTh)的表达特征分析首先,利用RT-PCR检测BmTh基因在胚胎发育1-10天的表达情况,发现浸酸后1-5天BmTh基因的表达量几乎检测不到,在6天时有很微弱的表达,从7天开始到10天孵化有强烈的表达。其次,从5龄4天到化蛾的发育时期芯片数据表明,BmTh基因在幼虫上簇60 h前后和化蛾前1天各有一次高量的表达。最后,借助于家蚕组织芯片数据库,对BmTh基因在家蚕5龄3天不同组织中的表达情况进行了分析,发现该基因在5龄3天的头组织中的表达量最高,在体壁中次之,而在其他组织中表达量很低或基本上不表达。1mRNA水平上的RT-PCR实验验证与芯片数据分析的结果相一致。3.家蚕酪氨酸羟化酶基因(BmTh)的组织原位杂交为了更清楚的了解BmTh基因在不同组织中的表达部位,我们在克隆的基础上合成特异的RNA探针,利用石蜡组织切片材料进行原位杂交实验。用RNA探针的反义链进行杂交,用正义链做对照,结果显示在家蚕头部边缘和眠期体壁内层的新皮处有绿色荧光信号。这与之前家蚕组织芯片数据,以及RT-PCR的实验验证结果相吻合,原位杂交的结果显示了该基因在头组织和体壁中表达的具体位置。4.家蚕酪氨酸羟化酶基因(BmTh)的干涉实验为了研究BmTh功能,本研究采用RNAi的方法,在胚胎早期注射不同浓度的BmTh-dsRNA。实验结果表明,注射BmTh-dsRNA后的胚胎发育成蚁蚕后,头部和体色由黑色变为咖啡色,且失去孵化能力；同时,利用荧光定量PCR对BmTh的表达量进行分子水平检测,结果显示注射高浓度(1000 ng／μL)组和低浓度(100 ng/μL)组与对照组相比,高浓度比低浓度在表达量上下降得更为明显。通过该实验,我们认为BmTh参与家蚕胚胎黑色素形成。在熟蚕期注射不同浓度的酪氨酸羟化酶抑制剂(3-indole-L-tyrosine,3-IT)后发现,当注射50 mM的浓度时会影响幼虫变态化蛹,推测其原因是由于注射的抑制剂抑制了家蚕酪氨酸羟化酶的活性,使得幼虫表皮的硬化程度不够,导致蜕皮不完全和化蛹困难；注射100mM时会使幼虫致死且体色变黑,这有可能是抑制剂注射量过大,导致蚕中毒而发黑。5.家蚕酪氨酸羟化酶(BmTH)的活性测定利用高效液相色谱(HPLC)测定不同温度下BmTH与底物酪氨酸反应后多巴的生成量来反应该酶的活性。在22℃到40℃的范围内,每间隔3℃作为一个温度点,分析发现31℃-34℃是BmTH的最适温度,在此温度下多巴的生成量最多,有最大的酶活性。对幼虫注射酪氨酸羟化酶抑制剂(3-IT)后进行检测,发现注射100 mM比注射50 mM能使酶的活性降低的更多,使得产物多巴的生成量减少。综上所述,结合本研究的实验结果及酪氨酸羟化酶基因在其他昆虫中的作用,我们认为家蚕酪氨酸羟化酶基因(BmTh)控制家蚕体内黑色素的形成和外骨骼的硬化,是家蚕正常发育不可缺少的关键基因。